樊 涛, 郭彦伟, 任金山, 苏书娟

(1南阳医学高等专科学校第一附属医院放疗科， 河南 南阳 473000； 2郑州大学第五附属医院肿瘤科， 河南 郑州 470000)

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，死亡率高，转移复发率高。导致其高死亡率的主要原因是卵巢癌的起病隐匿，大多数患者确诊时已到达晚期，并出现了远端转移，因此进行手术治疗难以去除癌灶，只能采取放化疗的规范性治疗[1-2]。但放化疗容易出现耐药性，且统计数据表明接受规范性治疗的患者仍有约60%的复发率。因此如何克服放化疗的耐药性是目前卵巢癌治疗研究中的重点问题。

紫草素(shikonin,Shk)是中药紫草科紫草属紫草的主要有效成分。已有研究表明紫草素具有抗炎、抗病毒、抗氧化、促进伤口愈合以及调节免疫功能等多种功效[3-4]。近年来，紫草素的抗肿瘤作用逐渐受到学者们的关注，已有报道指出紫草素对乳腺癌、宫颈癌和白血病等具有一定的抑制作用[5-7]。研究表明，紫草素可能通过上调Bax表达以及下调Bcl-2表达来抑制人卵巢癌细胞SKOV-3的体外增殖，并诱导其凋亡[8]。但鲜有紫草素对卵巢癌细胞放射敏感性的研究报道。本实验通过体外培养人卵巢癌细胞株SKOV-3，采取紫草素与X射线联合干预，探讨紫草素对SKOV-3细胞的放射增敏作用并讨论可能的作用机制。

材 料 和 方 法

1 实验材料

人卵巢癌细胞株SKOV-3购自中国科学院上海细胞所。胰蛋白酶和RPMI-1640培养液购自HyClone；胎牛血清购自Gibco；MTT试剂、抗β-actin抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体购自碧云天生物技术有限公司；Shk购自中国药品生物制品鉴定所；青霉素和链霉素购自华北制药股份有限公司；碘化丙啶(propidium iodide,PI)购自上海联硕生物科技有限公司；小鼠抗人p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT抗体购自Santa Cruz；其它试剂购自国产分析纯。

2 方法

2.1细胞培养 向SKOV-3细胞株加入适量含10%胎牛血清、青霉素与链霉素各1×105U/L的RPMI-1640培养液，培养于37 ℃、5%CO2的培养箱。收集处于对数生长期的细胞，用0.25%胰酶消化，并调整细胞密度为2×109/L。

2.2SKOV-3细胞活力的检测 收集处于对数生长期的SKOV-3细胞，调整细胞浓度为2×107/L，接种于96孔培养板中，加入紫草素使最终浓度为0、5、10、20、40、80和120 mg/L(其中以0 mg/L为空白对照组)，培养于37 ℃、5%CO2的培养箱48 h，加入MTT溶液继续培养4 h，每孔加入二甲基亚砜150 μL，于570 nm处检测吸光度(A)，并计算细胞相对活力。细胞相对活力(%)=(药物组A值-空白对照组A值)/(对照组A值-空白对照组A值)×100%，每个浓度设3复孔，绘制存活曲线。

2.3克隆形成实验 实验分为2组，放射组：仅给予不同剂量(0、2、4、6和8 Gy)X射线照射处理；联合组：给予8 mg/L紫草素和不同剂量(0、2、4、6和8 Gy)X射线照射处理。照射方法：将培养板放置于照射野(20 cm×20 cm)内，直线加速器6 MV-X线照射，源皮距(SSD)为80 cm，剂量率为300 cGy/min。联合组在照射前采用紫草素培养48 h，更换含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，继续培养7 d。PBS液洗涤2次，甲醛固定，吉姆萨液染色，晾干，计数。多靶单击型模型公式SF=1-(1-e-D/D0)N拟合细胞存活曲线，其中SF为细胞存活分数，D为放射剂量(Gy)，D0代表平均致死剂量，N为外推数，lnN=Dq/D0，Dq代表准阈剂量。并计算放射增敏比(sensitization enhancement ratio,SER)，SER=D0放射组/D0联合组。

2.4SKOV-3细胞周期的检测 收集处于对数生长期的SKOV-3细胞，制成细胞悬液，调整浓度为2×107/L，实验分4组：空白对照组(control组)、单药组(Shk组，8 mg/L Shk)、照射组(8 Gy组，8 Gy X射线照射处理)和联合组(Shk+8 Gy组，给予8 mg/L紫草素培养48 h后再进行 8 Gy X射线照射处理)。分别将加药与照射完毕的细胞置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养24 h，收集细胞并调整浓度为1×109/L。800×g离心10 min，PBS洗涤2次，重悬细胞，加入4 μL碘化丙啶，采用流式细胞仪观察细胞周期的变化。

2.5Western blot检测相关蛋白表达 收集SKOV-3细胞，细胞裂解液裂解，提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，进行SDS-PAGE，电转至PVDF膜，TBST液洗膜2次，将PVDF膜转移至装有封闭液的器皿中室温下封闭2 h，TBST液洗膜3次，加入I抗(抗PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT和β-actin抗体，均按照1 ∶2 000稀释)，4 ℃条件下孵育过夜，TBST液洗膜3次，加入相对应的II抗辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(1 ∶2 000稀释)室温孵育1 h，TBST液洗涤3次，化学发光法显色，成像扫描分析系统保存图像。

3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行处理。所有数据采用均数±标准差(mean±SD)表示。两组间均数比较采用独立样本的t检验；多组均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 MTT法检测SKOV-3细胞活力

在0～80 mg/L浓度范围内SKOV-3细胞活力随紫草素浓度增大而降低，而80 mg/L与120 mg/L紫草素时SKOV-3细胞活力无差异，IC50为(38.54±0.57) mg/L，见图1。后续实验采用20%×IC50作为实验研究浓度，即8 mg/L。

2 紫草素对SKOV-3细胞放射增敏作用

与放射组相比，经过紫草素与X射线联合处理后的SKOV-3细胞的存活曲线左移，放射生物学参数Dq、Do和N的值均降低，见表1、图2。SER为1.45±0.05。

Figure 1.Effect of shikonin on the viability of SKOV-3 cells. Mean±SD.n=6.

图1紫草素对SKOV-3细胞活力的影响

表1 紫草素对SKOV-3细胞放射生物学参数的影响

*P<0.05vsradiotherapy group.

Figure 2.Effect of shikonin on the survival curve of SKOV-3 cells. A: clone formation experiment； B: cell survival curve fitting using multi-target single-hit model. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsradiotherapy group.

图2紫草素对SKOV-3细胞存活曲线的影响

3 紫草素对SKOV-3细胞周期分布的影响

流式细胞术结果显示，与control组相比，Shk组的SKOV-3细胞G2/M期比例无显著差异；8 Gy组的SKOV-3细胞G2/M期所占比例显著高于control组(P<0.05)；Shk+8 Gy组的SKOV-3细胞G2/M期所占比例显著低于8 Gy组，却显著高于control组与Shk组(P<0.05)，见图3。

4 PI3K与Akt蛋白表达及其磷酸化水平

以β-actin为内参照，与control组相比，Shk组的p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平略下降，但不具有统计学差异，经过射线照射后，p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，Shk联合射线照射后，显著降低p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平(P<0.05)，见图4。

讨 论

实验结果显示在0～80 mg/L浓度范围内随紫草素浓度增大，对SKOV-3细胞存活率的抑制作用逐渐增强，提示紫草素对卵巢癌细胞株细胞SKOV-3的增殖具有抑制作用。当紫草素浓度到达约80 mg/L时，SKOV-3细胞随紫草素浓度增加不再发生明显改变，IC50为(38.54±0.57) mg/L。研究表明，理想的放射增敏剂本身对肿瘤组织作用不强且较小剂量即有放射增敏的作用[9]，因此常选用IC50的20%，即接近无毒浓度进行放射增敏研究，后续实验中采用紫草素的浓度为8 mg/L。多靶单击模型绘制SKOV-3细胞的存活曲线显示，不同照射剂量联合组的细胞存活率均低于放射组，提示紫草素具有增强X射线对卵巢癌细胞SKOV-3的杀伤作用；与放射组相比，联合组的存活曲线往左下方偏移，Dq值减小，肩区减少，提示紫草素对卵巢癌细胞的亚致死性损伤修复能力减弱，D0值减少，提示紫草素具有增加卵巢癌细胞X射线敏感性的作用。

Figure 3.Effect of shikonin on cell cycle of SKOV-3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs8 Gy group.

图3紫草素对SKOV-3细胞周期分布的影响

细胞的放射敏感性随周期时相变化而有所不同，G2/M期的细胞对射线最为敏感，并在M期达到峰值，S期细胞对射线的敏感性最差，因此细胞处于G2/M期肿瘤细胞受到射线放射引起DNA损伤后，会导致细胞周期被阻滞于G1/S期或G2/M期，进行DNA损伤的修复[10]，未能成功修复则启动凋亡信号使细胞产生凋亡[11]。研究显示，当细胞进入G2/M期，细胞的放射敏感性最高[11]。一般肿瘤细胞失去G1/S期检测点的调控，放射诱导产生DNA损伤后显示G2/M期阻滞[12]。而细胞G2/M期阻滞越明显，越有利于细胞辐射后损伤的修复，对于肿瘤的放射治疗不利。克隆形成实验结果显示，紫草素在一定程度上可以缓解X射线照射引起的SKOV-3细胞G2/M期阻滞，从而增加SKOV-3细胞的放射敏感性。推测紫草素通过降低SKOV-3细胞G2/M期阻滞，影响细胞有丝分裂周期及转录，从而发挥诱导细胞凋亡的作用。

Figure 4.Effect of shikonin on the protein levels of p-PI3K and p-AKT. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs8 Gy group.

图4紫草素对p-PI3K与p-AKT蛋白表达的影响

PI3K/AKT信号通路受多种因素，多个步骤调节，研究发现，AKT的Ser473位点磷酸化后，可激活其下游各种因子，进一步调节细胞各种生物学活动[13]。近年观察在放射低敏感性肿瘤细胞中，PI3K/AKT信号通路存在过度激活的现象[14]。本实验结果提示紫草素能够降低SKOV-3细胞中PI3K和AKT的磷酸化水平，推测可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路的激活，从而提高SKOV-3细胞的放射敏感性。

综上所述，本实验通过体外细胞学的研究，证实了紫草素对卵巢癌细胞SKOV-3具有提高放射敏感性的作用，其主要机制可能涉及到抑制PI3K/AKT信号通路和改变细胞周期分布。