周 凯， 王 磊， 海力茜·陶尔大洪

(新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011)

关健词： 库尔勒香梨； 多糖； 提取； 响应面

库尔勒香梨(PyrussinkiangensisYu)为蔷薇科梨属新疆梨种的果实，是瀚海梨与鸭梨的杂交品种，种植历史达1 400余年[1]。库尔勒香梨是新疆特有品种，因产自库尔勒地区而得名[2-3]，库尔勒香梨尤以其独特的气味和口感享誉国内外[4]。研究表明库尔勒香梨主要化学成分为多糖、甾体、黄酮、三萜和挥发油等，其中多糖含量相对较高[5-6]。植物多糖具有提高机体免疫力，毒副作用小的优点[7]。本课题组前期研究发现库尔勒香梨多糖具有调节免疫和镇咳化痰作用[8-9]。本研究采用单因素试验和响应面法对库尔勒香梨多糖提取工艺进行优化，旨在为更好地开发库尔勒香梨资源提供研究基础，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器752N型紫外分光光度仪(上海精科仪器厂)，ML-204型电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)，N-1100型旋转蒸发仪(日本东京理化器械工厂)。

1.2试药无水乙醇(山东佰仟化工有限公司，批号10009218)，葡萄糖标准品(天津市天新精细化工开发中心，批号20150520)，苯酚(天津市北联精细化学品开发有限公司，批号20160711)，葡萄糖(成都维克奇生物科技有限公司，批号 H5102634)，苯(四川科伦药业股份有限公司，批号 2015312)，浓硫酸(河南升宏化工产品有限公司，批号20161212)。

1.3药材库尔勒香梨2017年8月购于库尔勒沙依东园艺场，经新疆医科大学药学院生药/天药教研室帕丽达·阿布力孜教授鉴定为库尔勒香梨(PyrussinkiangensisYu)的果实。

2 方法与结果

2.1库尔勒香梨多糖供试液的制备库尔勒香梨洗净去核切片，于通风阴凉处晾干，称取5.00 g于圆底烧瓶，按质量体积比为1∶60(g∶mL)加入蒸馏水，90℃浸渍提取2次，每次180 min，合并2次提取液，旋蒸浓缩，浓缩液用无水乙醇调整至乙醇浓度为80%，于4℃冰箱放置12 h后待沉淀析出，弃上清液，沉淀置于蒸发皿中90℃水浴加热浓缩至膏状，晾干即得库尔勒香梨多糖。称取库尔勒香梨多糖40.00 mg，置于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，得0.40 mg/mL 的库尔勒香梨多糖供试液，备用。

2.2回归方程的建立称取葡萄糖标准品40.00 mg于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，得到浓度为0.40 mg/mL 的葡萄糖标准品溶液。分别取葡萄糖标准品溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL置于50 mL容量瓶中，取等量蒸馏水作空白对照，冰水浴5 min，分别加入0.2 %蒽酮-硫酸试液(称取0.2 g蒽酮加100 mL浓硫酸)4.0 mL，用蒸馏水定容至刻度，100℃水浴加热15 min，冷却至室温，静置10 min，在490 nm处测定其吸光度。以吸光度为纵坐标(Y)，葡萄糖标准品溶液浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，得回归方程:Y=12.079X+0.092 5,r=0.999 7，在0.010 5～0.065 2 mg/mL浓度范围内回归方程线性关系良好。

2.3方法学考察

2.3.1 精密度实验 取“2.2”项下葡萄糖标准品溶液6 mL置于50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，按“2.2”项下方法测定吸光度，平行测定6次，吸光度值分别为：0.677、0.678、0.679、0.679、0.676、0.678，RSD=0.2%(n=6)，表明方法精密度良好。

2.3.2 重复性实验 取“2.1”项下库尔勒香梨供试液6.0 mL置于50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，按“2.2”项下方法操作测定吸光度，平行测定6次，吸光度值分别为：0.235、0.230、0.232、0.232、0.239、0.234，RSD=1.4%(n=6)，表明方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性实验 取“2.1”项下库尔勒香梨供试液6.0 mL置于50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，按“2.2”项下方法操作，测定分别放置5、10、15、20、25和30 min时的吸光度，吸光度值分别为：0.247、0.238、0.245、0.239、0.245、0.243，RSD=1.5%(n=6)，表明30 min内实验稳定性良好。

2.3.4 加样回收率实验 取9份“2.1”项下库尔勒香梨供试液1.0 mL 置于50 mL容量瓶中，分别加入“2.2”项下葡萄糖标准品溶液1.0、2.0、3.0 mL各3份，蒸馏水定容至刻度，按“2.2”项下方法测吸光度，计算平均加样回收率为101.8%，RSD=1.8%。

2.4单因素实验

2.4.1 提取温度对库尔勒香梨多糖提取率的影响 按“2.1”项下操作在提取时间为120 min，料液比为1∶60(g∶mL)，提取次数为2次的条件下，设定提取温度分别为：60、70、80、90℃，提取库尔勒香梨多糖。随着提取温度的升高，库尔勒香梨多糖提取率先增大后减小，当提取温度为70℃ 时，多糖提取率最高，见表1。

表1 不同提取温度对库尔勒香梨多糖提取率的影响

2.4.2 提取时间对多糖提取的影响 按“2.1”项下操作，固定提取温度为70℃，料液比为1∶60(g∶mL)，提取次数为2次的条件下，设定提取时间分别为：90、120、150、180 min，提取库尔勒香梨多糖，当提取时间为180 min时，多糖提取率最高，见表2。

表2 不同提取时间对库尔勒香梨多糖提取率的影响

2.4.3 料液比对多糖提取率的影响 按“2.1”项下操作，固定提取温度70 ℃，提取时间120 min，提取次数为2次，设定料液比依次为1∶40，1∶50，1∶60，1∶70(g∶mL)，提取库尔勒香梨多糖，当料液比为1∶60(g∶mL)时，多糖提取率最高，见表3。

表3 不同料液比对库尔勒香梨多糖提取率的影响

2.4.4 提取次数对多糖提取率的影响 按“2.1”项下操作,固定提取温度为70 ℃、提取时间为120 min，料液比1∶60(g∶mL)，改变提取次数，设定提取次数分别为1、2、3次，提取库尔勒香梨多糖，提取次数为3次时，提取率最高，见表4。

表4 不同提取次数对库尔勒香梨多糖提取率的影响

2.5Box-Behnken响应面试验

2.5.1 响应面实验设计 从单因素实验的考察结果中选取提取温度(A)、提取时间(B)、料液比(C)3个对库尔勒香梨多糖提取率显著影响的因素，设计3因素3水平的响应面分析方法，响应面的影响因素水平表及17个试验点的响应面设计，见表5、6。

表5 响应面的影响因素水平表

2.5.2 响应面实验数据 以库尔勒香梨多糖提取率为响应面值Y，利用Design-Expert 8.0.5软件进行多元回归拟合分析，得到如下拟合全变量二次回归方程：Y=12.42+0.065A+0.37B-0.28C-0.065AB-5 000AC-0.24BC-1.09A2-1.24B2-2.83C2。由F值大小判断，各因素对库尔勒香梨多糖提取率的影响大小顺序为：B>C>A，见表7。

表6 响应面实验设计表

表7 响应面二次模型方差分析表

2.5.3 响应面实验设计结果 由各因素交互作用影响的响应面图显示，位于中心的点为库尔勒香梨提取率最高点。优化的最佳提取条件为在回归方程中A2、B2、C2对库尔勒香梨多糖提取率影响极显著，AB、BC和AC对多糖提取率影响不显著。根据模型优化的最佳提取条件为：提取温度70℃、料液比1∶60、提取时间95 min，此时提取率为12.46%,见图1～3。

图1 A(温度)、C(料液比)交互作用影响的响应面图

图2 B(时间)、C(料液比)交互作用影响的响应面图

图3 A(温度)、B(时间)交互作用影响的响应面图

2.6验证实验选取响应面法得出的库尔勒香梨多糖提取工艺的最优条件，进行3次平行试验，验证最优工艺的准确性，实测值与预测值相对误差基本一致，说明理论提取工艺有效可行，见表8。

表8 验证实验结果表

3 讨论

本研究对库尔勒香梨多糖提取方法进行了单因素考察和响应面优化，经过最佳工艺的验证实验，得到了库尔勒香梨提取工艺最佳条件：提取时间95 min、料液比1∶60、提取温度70℃。采用此方法提取库尔勒香梨多糖的提取率为12.46%，提取率较高，且提取方法和提取结果稳定可靠，可以为后续对库尔勒香梨多糖的分离纯化、结构鉴定及活性研究提供研究的物质基础。针对库尔勒香梨多糖的提取方法还有超高压法、超声波提取法等[10-11]，与本实验提取方法相比较，其提取率更高，但由于条件剧烈，不排除其方法会对多糖的结构造成一定破坏，具体还需进行深入的研究。近年来，一些新的提取方法也越来越多的运用到了植物多糖的提取过程中，例如，冷冻提取法、闪式提取法、总黄酮和总多糖联合提取法和复合酶提取法，这些提取方法操作更加简便，但提取率相对较低[12-16]。本研究提取方法条件温和，提取试剂仅有水和乙醇，可最大程度保证多糖结构的稳定并减少杂质的引入，适用于库尔勒香梨多糖的提取。