马 蓉， 刘 清， 张 潇， 郑树涛， 刘 涛， 申铜雪， 韩秀娟， 卢晓梅

(新疆医科大学1临床医学研究院， 2第五附属医院消化科， 3健康管理学院， 乌鲁木齐 830011)

丙酮酸激酶(PK)是糖酵解最后一步限速酶，包括M1、M2、L和R4个亚型，其中丙酮酸激酶M2(PKM2)在肿瘤的发生、发展中起到关键作用。研究发现PKM2在多种肿瘤组织中高表达[1-3]，在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的宫颈癌上皮间质转化(EMT)进程中，PKM2的蛋白表达水平升高[4]，但PKM2在食管鳞状细胞癌(ESCC)中作用机制少有报道。本研究在KYSE150细胞中加入TGF-β1，在过表达PKM2的食管癌KYSE150细胞中加入TGF-β1抑制剂，应用Transwell及细胞划痕检测KYSE150细胞侵袭、迁移能力变化，应用Western blots检测PKM2蛋白水平表达变化，以探讨PKM2在TGF-β1诱导的食管癌细胞侵袭、迁移中的作用。

1 材料与方法

1.1材料食管鳞状细胞癌KYSE150细胞购自中国科学院上海分院细胞库，1640培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(Gbico公司)，TGF-β1 (PeproTech公司)，TGF-β1 抑制剂(上海吉凯公司)，Transwell小室购于Corning公司，慢病毒构建及包装(上海吉凯公司)，Matrigel(BD公司)，PKM2、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体购自Proteintech公司。

1.2方法

1.2.1 细胞培养 食管鳞状细胞癌KYSE150细胞用含10%胎牛血清、青霉素(100 IU/mL), 链霉素(100 IU/mL)的1640培养基置于37℃、5%CO2培养箱内培养，隔天换液，细胞长满细胞培养瓶的80%～90%传代。

1.2.2 TGF-β1处理细胞 食管鳞状细胞癌KYSE150细胞接种于6孔板，细胞培养基更换为无血清培养基，在培养基中加入TGF-β1(10 ng/mL)培养24 h，作为TGF-β1组，加入PBS作为Control组。

1.2.3 慢病毒转染 将对数生长期的KYSE150细胞接种于六孔板内，当细胞密度达到70%～80%时可进行慢病毒转染，根据试剂盒要求加入适量过表达PKM2的慢病毒(MOI：20)、聚凝胺(polybrene,5 μg/mL)、ENi.S，孵育72 h后用流式细胞仪进行分选，之后继续培养传代、冻存。

1.2.4 TGF-β1抑制剂处理细胞 将过表达PKM2的KYSE150细胞及未进行慢病毒转染的KYSE150细胞接种于6孔板，细胞培养基更换为无血清培养基，在培养基中加入TGF-β1抑制剂(10 μm/mL)培养24 h。未进行慢病毒转染也未加入TGF-β1抑制剂的细胞为Control组，未进行慢病毒转染但加入TGF-β1抑制剂的细胞为TGF-β1 inhibitor组，过表达PKM2，但未加入TGF-β1抑制剂的细胞为Overexpress PKM2组，过表达PKM2同时加入TGF-β1抑制剂为Overexpress PKM2+TGF-β1 inhibitor组。

1.2.5 细胞划痕实验 接种对数生长期的食管鳞状细胞癌KYSE150细胞于六孔板上，当细胞密度达到90%左右时，用10 uL无菌枪头在六孔板底部垂直画一条粗细一致的直线，每组试验重复3次，每组设立3个重复，分别于0、48 h于倒置相差显微镜下观察同一视野划痕宽度并拍照。

1.2.6 Transwell实验 Transwell小室上室每孔加入60 μL配好的基质胶，放入培养箱2 h使其干燥，用无血清培养基将对数生长期的KYSE150细胞重悬，上室加入200 μL含5×104个细胞的悬液，下室加入500 μL含20%胎牛血清的培养基，置于37℃，5%CO2培养箱24 h，4%多聚甲醛固定30 min，1%结晶紫染色10 min，棉签擦拭小室上室，倒置显微镜下观察5个视野，计算每个视野的穿膜细胞数，取平均值，每组试验重复3次，每组设立3个重复。

1.2.7 Western blot检测PKM2蛋白水平的表达变化 收集KYSE150细胞，用RIPA裂解液裂解细胞，离心取上清进行蛋白浓度测定，以50 μg/孔蛋白量进行电泳，之后用聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜转膜90 min，脱脂奶粉封闭1 h，PKM2、GAPDH一抗(均为1∶1 000)4℃过夜,次日荧光二抗(1∶15 000)避光室温孵育1 h，最后用CL×红外成像系统(Odyssey公司)显影，以GAPDH作为内参，每组试验重复3次，每组设立3个重复。

2 结果

2.1TGF-β1对食管癌细胞侵袭、迁移能力的影响与Control组比较，TGF-β1刺激KYSE150细胞24 h后穿过基质膜的细胞数明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)(图1a、b)。与Control组比较，TGF-β1刺激KYSE150细胞48 h后其划痕愈合能力增强，差异有统计学意义(P<0.05)(图1c、d),以上结果表明TGF-β1可以促进食管癌细胞的侵袭、迁移。

2.2TGF-β1对PKM2蛋白表达水平的影响TGF-β1组PKM2蛋白水平表达高于Control组，说明TGF-β1可以促进PKM2蛋白水平的表达(图2)。

a： Transwell细胞侵袭试验(放大倍数200×)； b： 穿出基质膜细胞数量； c： 细胞划痕试验(放大倍数100×)； d： 细胞相对迁宽度(注：与Control组比较， *P<0.05)

a：TGF-β1刺激KYSE150细胞后Western blot结果； b：TGF-β1刺激KYSE150细胞后Western blot检测PKM2/GAPDH的量化结果(注：与Control组比较， *P<0.05)

2.3PKM2在TGF-β1诱导的食管癌细胞侵袭、迁移中的作用与TGF-β1 inhibitor组比较，Overexpress PKM2+ TGF-β1 inhibitor组迁移、侵袭能力增强，差异有统计学意义(P<0.05)(图3)，以下结果说明PKM2在TGF-β1诱导的食管癌的侵袭、迁移中起促进作用。

a：细胞划痕试验(放大倍数100×)；b：细胞相对迁移宽度；c：Transwell细胞侵袭试验(放大倍数200×)；d：穿出基质膜细胞数量(注：与TGF-β1 inhibitor组比较， *P<0.05)

3 讨论

食管癌是起源于食管上皮细胞的恶性肿瘤[5]，在我国最常见的组织学类型是食管鳞状细胞癌[6]，浸润转移仍然是导致食管癌患者生存率低，预后差的主要原因[7]。PKM2是肿瘤细胞有氧糖酵解的最后一步的限速酶[8]，具有丙酮酸激酶活性的四聚体调控肿瘤细胞的有氧糖酵解，具有蛋白激酶活性的二聚体入核调控下游的靶基因，从而促进肿瘤恶性增殖[9]。有研究发现应用慢病毒转染干扰PKM2在肿瘤中的表达后，肿瘤细胞的凋亡显著增加，增殖减慢[10]。文献报道PKM2可以通过使细胞外信号调节激酶1/2(ERKl/2)磷酸化来促进肿瘤生长、转移[11]。Yu等[12]报道在EGF及TGF-β1的刺激下，结肠癌细胞核内PKM2表达增加。众所周知，TGF-β1在多种肿瘤的侵袭、转移转移中发挥作用，但目前PKM2在TGF-β1诱导的食管癌细胞侵袭、迁移中的作用机制尚无报道。

本研究应用TGF-β1刺激KYSE150细胞后应用细胞Transwell试验、划痕试验及western blot检测食管癌细胞迁徙、迁移及PKM2蛋白水平表达变化，结果显示,与Control组比较，TGF-β1刺激KYSE150细胞后穿过基质膜的细胞数及划痕愈合能力均明显增加，PKM2的蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。为了进一步探讨PKM2在TGF-β1诱导的食管癌细胞侵袭、迁移中的作用，本研究用TGF-β1抑制剂处理过表达PKM2的食管癌细胞，发现过表达PKM2减弱了TGF-β1抑制剂对KYSE150细胞侵袭、迁移能力的抑制作用，说明PKM2对TGF-β1诱导的食管癌细胞侵袭、迁移起促进作用。