乔瑞娟， 程 睿， 李 威， 彭火英， 赵桂增， 张晨光

(1.新乡医学院医学检验学院，河南 新乡 453003； 2.大庆油田总医院检验科，黑龙江 大庆 163001)

肺结核病(pulmonary tuberculosis，PTB)是由结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的慢性肺部疾病，严重威胁人类健康[1]。全世界约有三分之一的人口感染了 MTB，但只有大约10%的感染者出现活动性结核病，而其余的则没有症状[2]，由此表明个体遗传因素与肺结核的易感性密切相关。单核苷酸多态性(SNPs)存在于人类染色体上且分布广泛，其可能影响启动子活性和基因表达，从而与疾病的发生发展有着密切的联系。目前国内外研究发现许多基因多态性与肺结核易感性相关，如 CCL5、ASAP1、TLR10 基因内的特定SNPs变异[3-5]。位于13号染色体的高迁移率族蛋白1(high-mobility group box 1 protein， HMGB1)是一种在哺乳动物中发现的普遍存在的核蛋白。HMGB1作为一种重要的晚期炎症介质，在肿瘤、免疫性疾病和感染性疾病的发病过程中起重要作用[6-8]。在抗结核感染过程中，MTB感染可以诱导单核及巨噬细胞分泌HMGB1，其浓度的高低可能反映结核病的严重程度[9]。由此推测HMGB1基因多态性可能与肺结核易感性有很大关联。迄今为止还未发现关于HMGB1 SNPs与肺结核易感性之间的关联研究。本研究是首次对豫北地区肺结核患者和健康人群HMGB1基因的3个SNPs进行病例对照研究，以探讨HMGB1 SNPs与豫北地区肺结核患者易感性的相关性，为肺结核的诊断治疗提供新的方向。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究选取2017年1—12月在新乡医学院第一附属医院被确诊为肺结核的320例患者作为结核组，诊断均符合我国肺结核的诊断标准(WS 196-2017)。排除标准为：(1)患心、肝、肾等疾病患者；(2)各类肿瘤及自身免疫性疾病患者；(3)慢性呼吸系统疾病如慢性支气管炎、支气管哮喘、支气管扩张的患者；(4)慢性感染如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病等患者。对照组由该院同时期300名健康体检者组成，均无慢性疾病及传染病。本研究经新乡医学院第一附属医院伦理委员会批准，事先获得参与本次研究的每位患者和健康者的知情同意，自愿参与本项研究。

1.2 基因组DNA提取 结核组和对照组分别采集2～3 mL EDTA-K2抗凝全血，根据制造商的说明书，通过外周血基因组提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)从 EDTA-K2抗凝全血中分离出全血 DNA。提取的全血 DNA 保存于-20℃冰箱备用。

1.3 SNPs选择及基因分型 选 择 rs1412125(-1615A/G)、rs1045411(+1177G/A)、rs2249825(+3814C/G)三个位点，都是常见SNPs，这些SNPs的次要等位基因频率均≥5%。rs1412125、rs1045411、rs2249825引物序列见表1。PCR扩增体系共26 μL，包括2×PFUMasterMix 12．5 μL(北京康为世纪生物科技有限公司)、去离子水10．5 μL、上下游引物各1 μL、DNA 1 μL。HMGB1 rs1412125扩增条件为：94℃ 5 min的初始变性，然后是94℃ 30 s，55．9℃ 30 s，72℃ 2 min，共循环35次，最后在72℃延伸5 min；HMGB1 rs1045411扩增条件为：94℃ 5 min的初始变性，然后是94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，共循环35次，最后在72℃延伸5 min；HMGB1 rs2249825扩增条件为：94℃ 5 min的初始变性，然后是94℃ 30 s，57．6℃30 s，72℃ 2 min，共循环35次，最后在72℃延伸5 min。所有的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，确定扩增目的产物的有无。扩增产物送公司进行测序，测序结果通过DNASTAR V7.0软件记录相应的SNPs位点。

表1 HMGB1 SNPs引物序列

2 结果

2.1 基本情况 320例结核组患者中男性123例(38．44%)，女性197例(61．56%)，平均年龄(37．91±11．01)岁。对照组300名健康体检者中男性102例(34．00%)，女性198例(66．00%)，平均年龄(38．57±10．89)岁。所有的参与者均为汉族。两组患者的年龄、性别、吸烟史、饮酒史情况比较，差异均无统计学意义(均P>0．05)。见表2。

2.2 两组间的3个 HMGB1 SNPs等位基因和基因型分布比较 两组间3个位点的基因型频率均符合 Hardy-Weinberg平衡(P>0．05)。rs1045411G/A位点 A 等位基因与肺结核的发病风险相关(OR=1．485，95%CI=1．110～1．986，P=0．007)，但两组间rs1412125A/G 和rs2249825C/G 位点等位基因频率差异无统计学意义(P>0．05)。见表3。在健康对照和肺结核患者中，rs1412125A/G、rs1045411G/A、rs2249825C/G位点的基因型分布最高频率分别为纯合AA、GG、CC，结核组和对照组的rs1045411G/A 基因型分布差异有统计学意义(P<0．05)，而rs1412125A/G、rs2249825C/G 基因型分布在两组间差异无统计学意义(P>0．05)，见表4。

表2结核组与对照组的基本特征[例(%)]

Table2Basic characteristics of tuberculosis group and control group(No. of cases[%])

基本特征结核组(n=320)对照组(n=300)χ2P性别 女197(61.56)198(66.00)1.3190.251 男123(38.44)102(34.00)吸烟史 有97(30.31)105(35.00)1.5490.213 无223(69.69)195(65.00)饮酒史 有77(24.06)84(28.00)1.2490.264 无243(75.94)216(72.00)

2.3 rs1045411G/A位点的遗传模型与肺结核易感性之间的关联 rs1045411G/A 位点的共显性模型中，与 GG 基因型相比，AG 基因型(OR=1．447，95%CI：1．025～2．041，P=0．035)和 AA 基因型(OR=2．812，95%CI：0．985～8．033，P=0．045)与肺结核的易感性相关；rs1045411G/A 位点的显性模型[(AG+AA) vs GG]也与肺结核的易感性相关(OR=1．524，95%CI：1．090～2．131，P=0．014)；而在rs1045411G/A位点的隐性模型中[(AG+GG) vs AA]，以及在rs1045411G/A 位点的超显性模型中[AG vs (GG+AA)]，病例组和对照组间差异无统计学意义(均P>0．05)，见表5。

表3 结核组和对照组的等位基因分布[例(%)]

注：两组间三个位点等位基因分布均符合H-W平衡(P>0.05)

表4结核组和对照组的基因型分布[例(%)]

Table4Genotype distribution in tuberculosis group and control group(No. of cases[%])

SNPs基因型病例组(n=320)对照组(n=300)χ2Prs1412125 A/GAA191(59.69)190(63.33)0.9890.610AG110(34.37)92(30.67)GG19(5.94)18(6.00)rs1045411 G/AGG196(61.25)212(70.67)7.5870.023AG111(34.69)83(27.67)AA13(4.06)5(1.66)rs2249825 C/GCC222(69.37)227(75.67)3.0740.215CG91(28.44)68(22.67)GG7(2.19)5(1.66)

2.4 连锁不平衡分析 rs1412125A/G与rs2249825C/G 之间 D′与r2分别为(0．24，0．30)；rs1412125A/G 与rs1045411G/A 之间 D′与r2分别为(0．53，0．22)；rs2249825C/G 与 rs1045411G/A之间 D′与r2分别为(0．37，0．10)。见图1。

图1 HMGB1 3个SNPs的连锁不平衡分析

Figure1Analysis on linkage disequilibrium of three SNPs of HMGB1

表5 rs1045411G/A 位点不同遗传模型与肺结核易感性的关联[例(%)]

3 讨论

肺结核是由 MTB引起的慢性肺部疾病，仅5%～10%的 MTB感染者会发展成具有临床症状的疾病，多达90%的感染者为无症状感染[1-2]，因此，应重点关注宿主的个体易感性。近年来，肺结核易感基因位点的多态性已经成为研究热点，研究[10]证明遗传因素与结核的感染和易感性密切相关。Mishra等[3]发现 CCL5的-403G>A SNPs 与 PTB 易感性存在显著关联。Curtis等[4]发现 ASAP1基因的SNPs与俄罗斯人群中 TB 的易感性相关。Li等[5]发现IFNG 基因rs2069718 TT 基因型与肺结核感染期间中的保护作用相关。因此，候选基因的选择和其多态性位点的检测一直被认为是 TB预防和治疗的突破。

HMGB1是一种存在于真核细胞内的非组蛋白染色体结合蛋白。HMGB1在细胞内外发挥多种作用，如免疫应答，DNA 修复，染色质稳定化，细胞凋亡和基因转录。HMGB1作为晚期炎症介质在肿瘤和各种炎症性疾病的发病机制中发挥关键作用[6-8]。与此同时，HMGB1在慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺癌、哮喘等慢性肺部疾病中有较高水平表达[10-13]，表明 HMGB1可能作为一种晚期促炎细胞因子参与肺部相关疾病的发病过程。肺结核患者体内的许多固有免疫细胞，如巨噬细胞、单核细胞是产生HMGB1的主要细胞[14]。HMGB1在肺结核组织和血清中表达升高，表明 HMGB1可能参与抗结核反应，并且可以一定程度上反映组织的损伤程度[9]。但目前尚未发现 HMGB1基因多态性与肺结核易感性有相关性的报道。因此，本研究是对 HMGB1基因多态性与豫北地区肺结核易感性的相关性首次探讨。

在本研究中，通过对HMGB1 rs1412125(-1615A/G)、rs1045411(+1177G/A)、rs2249825(+3814C/G)三个位点SNPs基因分型来检测HMGB1基因多态性与 PTB 易感性的关联。研究发现，+1177G/A位点A等位基因可增加患肺结核的风险(OR=1．485，95%CI：1．110～1．986，P=0．007)。进一步研究发现，+1177G/A 基因型分布在结核组和对照组间差异具有统计学意义(P=0．023)，AG 基 因 型 (95%CI：1．025～2．041，P=0．035)发生肺结核风险是 GG 基因型的1．447倍，AA 基因型(95%CI：0．985～8．033，P=0．045)发生肺结核风险是 GG 基因型的2．812倍。这些数据表明rs1045411(+1177G/A)位点多态性与肺结核的易感性相关。基因3’侧翼区域的多态性可以控制基因表达，rs1045411(+1177G/A)多态性位于3’侧翼区域，因此可能影响HMGB1基因的表达[8]，rs2249825(+3814C/G)多态性虽位于内含子1中，但可能会影响v-Myb的结合位点，这被证明是HMGB1表达的强有力的增强子[15]，但在本研究中未发现rs2249825多态性与肺结核的易感性相关，rs1412125(-1615A/G)位于 HMGB1上游-1615碱基对，它可能与人类切割的同源域结合，后者在抑制转录中起作用并起到转录抑制因子的作用[16]；然而，该 SNPs也未发现与肺结核的易感性相关。为了找到最理想遗传模型，本研究建立了rs1045411(+1177G/A)基因多态性的共显性、显性、隐性和超显性模型。在rs1045411(+1177G/A)位点的显性模型[(AG+AA) vs GG]也发现可以显著增加患肺结核的风险(OR=1．524，95%CI：1．090～2．131，P=0．014)，而在rs1045411位点的隐性模型和超显性模型中，结核组和对照组间差异无统计学意义。连锁不平衡在人类基因组中表达，可以用作遗传标记定位参与疾病检测和治疗的相邻变体，然而本次研究的 HMGB1的3个位点未发现连锁现象(r2<0．8)。

总之，本研究提示rs1045411(+1177G/A)位点多态性与肺结核的易感性显著相关，同时为肺结核分子水平发病机制的确定提供基础，这项研究可能会对肺结核的发展和治疗提供新的思路。然而这项工作的局限性是缺乏患者的生存数据。因此，HMGB1多态性是否与肺结核患者的生存有关需要进一步检查。此外，需要包含更多个体的更大型研究来检查HMGB1多态性在肺结核进展中的功能。