干华磊，王承芳，郝文娟，叶乃玮，毛伟力



复合木霉菌制剂防治草莓苗枯萎病的研究

干华磊，王承芳，郝文娟，叶乃玮，毛伟力*

（上海万力华生物科技有限公司，上海 200000）

将木霉（spp.）菌株Tr14、Tr25、Tr85分别制成含2×108g-1孢子的单菌株、双菌株（Tr14+Tr25；Tr14+Tr85；Tr25+Tr85）或三菌株（Tr14+Tr25+Tr85，TM3）复合可湿性粉剂（WP），用于防治草莓枯萎病（f. sp. fra-gariae）的室内药效生测试验。结果表明：经TM3 WP 200倍，30%精甲·噁霉灵WP 1 500倍以及Tr14+Tr85双菌株复合WP处理的草莓苗，在发病率（，%）和防治效果（，%）上，无显著差异，但它们（/）都显著地低于（≤0.05）或高于（≤0.05）经单菌株200倍、其他双菌株复合WP 200倍、以及空白对照处理的草莓苗。继续将TM3 WP分别用于2016、2017年上海、北京、福建和重庆的两年四地的田间药效试验。结果显示，经TM3 WP 100、200倍、以及30%精甲·噁霉灵1 500倍处理的草莓苗，其两年四地的值和值，都显著地低于（≤0.05）或高于（≤0.05）经TM3 WP 400倍、枯草芽孢杆菌1 000倍、以及空白对照处理的草莓苗。

木霉菌；草莓枯萎病；生物防治；防治效果

草莓（Duch）属蔷薇科、草莓属、多年生草本植物。其果实柔软多汁、可口、营养丰富而备受欢迎，并具有重要的经济地位[1-3]。随着设施栽培面积的不断扩大，由尖孢镰刀菌草莓专化型（f. sp. fra-gariae）[4]引起的草莓枯萎病在我国主要的草莓种植区普遍发生，危害程度逐年加重[5]。当连作种植时，草莓枯萎病的发病率可高达89.2%[6]。病原菌可通过农具、种苗、土壤灌溉水等方式传播，也可以通过病残体，在草莓分苗或移栽时传播蔓延。病原菌从根部伤口侵入，在根和茎的维管束内繁殖并分泌毒素，破坏植株疏导机能和正常生长。该病害可从苗期或开花期一直延续至收获期。植株一旦发病将导致结实率降低、果实膨大异常、品质下降[7]。

目前用于防治草莓枯萎病的方法主要包括：农业防治、物理防治、化学防治和生物防治。农业防治主要采用轮作、种苗移栽前脱毒、选育抗病品种以及高架基质栽培等技术，但这些技术提高了劳动强度和生产成本，未能在草莓种植中得到广泛应用[8]。物理防治主要采用高温土壤灭菌，但该方法存在劳动强度大和灭菌不彻底的问题[8]。目前防控草莓枯萎病主要采用化学防治，常用药包括百菌清、代森锰锌、特克多、多菌灵和甲基托布津等杀菌剂。但是，长期使用这些药剂会导致病原菌对这些药剂产生抗药性，使防治效果逐年降低，同时也使草莓产量、生态环境和食品安全都受到威胁[1]。因此，开发能有效防治草莓枯萎病的新药，并能减少化学残留、提高食品安全，是整个草莓产业的当务之急。科研人员已采用了许多有拮抗功能的生防菌来防控植物病害。目前常用的生防菌主要有：①木霉菌（spp.）；②芽抱杆菌属细菌（spp.）；③假单胞菌属细菌(spp.)等[9]。Ji M X等[10]利用枯草芽孢杆菌DJ-6与吡唑醚菌酯的混配药剂，对草莓枯萎病原菌有显著的抑菌活性，其田间防效能够达到93.11%。陈宏州等[11]利用NF0919菌株发酵液和申嗪霉素对草莓枯萎病进行药效测试，防效分别达到65%和90%。本研究将相容性好，对草莓枯萎病原菌有拮抗功能的木霉菌株，分别制成单菌株、双菌株和三菌株复合WP，对草莓枯萎病进行了室内和两年四地的大田药效试验，为生物农药防控草莓枯萎病提供了依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株 木霉菌（spp.）：菌株Tr14、Tr25、Tr85、Tr121、T266由上海万力华生物科技有限公司（上海万力华）提供。

病原菌：尖孢镰刀菌(f. sp，FU-1) 由上海万力华提供。

1.1.2 供试培养基 马铃薯葡萄糖培养基（PDA，土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，水1 000 mL）； 马铃薯葡萄糖肉汤（PDB，土豆200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL）。

1.1.3 草莓苗和试验基地 室内生测：草莓苗（红颊）和试验基地都由上海市青浦区白鹤草莓研究所提供；大田测试：上海浦东新场小王草莓园、北京绿水峡谷果蔬合作社、福建省宁德市七都镇关庴村、重庆北碚区东阳镇。

1.1.4 供试药剂 30%精甲·噁霉灵，由四川国光农化股份有限公司提供；Tr14、Tr25、Tr85单菌株、双菌株、三菌株复合WP，由上海万力华提供；1 000亿/g枯草芽孢杆菌，由武汉天惠生物工程有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 木霉菌相容性测试 将供试的5株木霉菌菌株，随机取3株菌株为一组，用打孔器（直径5 mm）取各菌株平板上菌落边缘的菌块，将其均匀接种于距平皿边缘2 cm的圆周上，每个处理重复3次。将平皿放置在28 ℃的培养箱中培养7 d后，观察和记录目标木霉菌株与其它木霉菌株之间的相容性反应。2个菌株生长之间不产生抑菌条带（抑菌圈）的为相容性好，反之为不相容。

1.2.2 室内生测筛选实验 （1）病原菌接种体培养。将草莓枯萎病菌（FU-1）接种于 PDA平皿上，在25 ℃培养箱内培养5 d，然后转接到装有200 mL高温灭过菌（121 ℃）的PDB培养液的中，放置于25 ℃摇床上以120 r/min培养5 d；用四层无菌纱布过滤收集病原菌的孢子液，并用无菌水将孢子液配制成孢子浓度为1.0×107个/mL，置于4 ℃冰箱中备用。将壤质菜园土与有机栽培基质(由山东商道生物科技有限公司提供)按1﹕1混匀后，然后装入直径为9 cm的塑料盆钵内备用。

（2）室内生测实验。室内盆栽试验于2016年8月10日在上海市青浦区白鹤草莓研究所温室大棚进行。先用无菌水冲洗红颊草莓苗根部的土壤，并剪掉部分侧根；然后将草莓苗浸蘸到1.0×107个/mL的FU-1孢子液中20 min；最后将草莓苗移栽到上述塑料盆钵内；以浸蘸无菌水为对照。将草莓苗移栽好后，分别用100 mL Tr14、Tr25、Tr85木霉菌各菌株的WP200倍液、3个菌株两两混合的WP200倍液、3个菌株混合的WP200倍液、30%精甲·噁霉灵1 500倍液对草莓苗进行灌根处理，每隔7 d灌根一次，共处理3次，以无菌水灌根为对照。每个处理供试20盆草莓苗，在药剂处理后对草莓苗进行常规水肥管理。

最后一次处理后30 d，调查各处理草莓枯萎病的发病情况，并计算防治效果。发病率和防治效果的计算公式为：

发病率=处理发病植株数/处理总株数×100% ①

防治效果=(对照发病率－处理发病率)/对照发病率×100% ②

1.2.3 大田药效试验 本次田间药效试验分别在2016年、2017年，上海浦东新场小王草莓园、北京绿水峡谷果蔬合作社、福建省宁德市七都镇关庴村、重庆北碚区东阳镇完成了试验；实验共设6个处理：TM-3 WP100倍、TM-3 WP200倍、TM-3 WP400倍、30%精甲·噁霉灵1 500倍、枯草芽孢杆菌1 000倍、空白对照。每个处理3次重复，每个重复有500株苗, 随机排列。试验分别于2016年10月8日和2017年10月10日，采用灌根方式进行用药，每株苗灌根100 mL，每隔7 d灌根一次，共处理3次。

调查时间和方法：于第3次药后7~14 d统计发病率，并计算防效；小区所有植株全部调查，调查各处理的病苗数，计算病苗率和防治效果；发病率和防治效果同1.2.2室内生测的计算方法，试验数据用邓肯新复极差法进行统计分析。

2 结 果

2.1 相容性测试结果

5个对FU-1生长抑制率强的木霉菌株Tr14、Tr25、Tr85、Tr775、Tr266，以Tr14作为目标菌株，测试Tr14与其它4个菌株之间的相容性。结果（表1和图1）显示，Tr14分别与Tr25和Tr85菌株相容性好，Tr25与Tr85相容性好，但Tr14与Tr775和Tr266不相容。

表1 木霉菌相容性测试结果

“＋”表示菌株之间相容性好，“-”表示菌株之间不相容

2.2 室内生测试验

根据相容性测试的结果，选择Tr14、Tr25、Tr85 3个菌株的单菌株、双菌株及3个菌株的混合WP以及化学农药30%精甲·噁霉灵进行室内生测试验。结果（表2）显示Tr14、Tr25、Tr85 3个菌株两两混合的WP处理，其枯萎病的发病率都在20%以下，而单菌株WP处理的发病率则都在25%以上；而3个菌株混合的WP处理其发病率则为9.8%，防效为83.2%，发病率明显低于而防效明显高于其他处理。

A：Tr14，B：Tr25，C：Tr85

2.3 田间药效实验

将Tr14、Tr25、Tr85 3个菌株的复合WP应用于两年四地的防治草莓枯萎病的田间药效试验，结果（表3）显示，在2016、2017两年四地的田间药效试验中，两年的实验数据基本一致。复合菌剂TM3 WP稀释100倍、200倍的处理的防效显著的高于稀释400倍的防效，而TM3-100和TM3-200处理之间两年的实验结果，两者都没有显著性差异，防效都达到了66.67%~87.23%。另外，复合菌剂TM3-100和TM3-200处理，与两个对照药剂的防效相比，都显著（≤0.05）的高于或者无显著差异，两个对照药剂的防效为58.6%~88.83%。

表2 复合木霉菌WP防治草莓枯萎病室内生测试验结果

同列数据后不同小写字母表示差异显著（≤0.05，Ducan氏新复极差法）

对比两年的数据中还可以看出，同一地区两年的病情指数有一些差异，同时不同地区相同的年份间病情指数同样也有差异。这主要与不同年份不同地区间的的天气情况有关。因为草莓枯萎病的发生与土壤湿度以及定植后的温度有比较大的关系。比如上海在2016年的草莓定植期间雨水较多，而2017年则相对少一些，所以2017年的病情指数要比2016年的低；而北京与上海相比，属于比较干燥的地区，雨水也相对较少，所以两年的病情指数相对上海以及其他地区的病情指数都要低。

表3 木霉菌复合菌剂防治草莓枯萎病田间药效实验结果

表中各数值是每个处理3个重复的平均值，同列数据后不同小写字母表示差异显著（≤0.05，Ducan氏新复极差法）

3 讨 论

草莓枯萎病是近几年草莓生产上遇到的较难防治的土传病害，尤其是在多年种植草莓的重茬地块，严重时可造成整个草莓区的毁园[12]。从目前对草莓枯萎病等病害的防治措施来看，种植户仍以化学药剂为主，生物农药为辅，应用化学药剂防治植物病害，虽能快速有效地达到防治目的，但长期单一使用，病原菌会产生抗药性[13]。所以当前，利用生物农药防治土传病是解决草莓连作障碍技术研究的热点。国内外也有很多研究报道利用微生物防治草莓土传病害。冯玉龙等[14]进行了利用拮抗芽孢杆菌发酵液的硫酸铵沉淀物防治草莓黄萎病的研究。徐淑华等[15]利用两株拮抗细菌和多种植物提取物防治草莓黄萎病，取得了初步成效。Porras等[16]对太阳能土壤消毒和木霉菌剂相结合的方法进行了试验研究，得出采用在太阳高温消毒后再添加生物菌剂的方法，两年防效可达84.5%。本研究通过拮抗筛选出的3个木霉菌复合菌剂WP经过两年四地的田效试验，两年的防效都能达到75%以上，试验效果稳定，与近年来的研究观点一致。

由于单一生防菌株适应性有一定限制，使用复合菌则可拓宽木霉菌的适应范围，有利于抵抗叶表和土壤不良的环境条件，同时强化生防效应，因为混合使用时菌株间的作用可能不只是简单的积加而具有了一定的协同性，提高了与病菌的竞争能力[17]。宋志伟等[18]用复合微生物制剂防治草莓黄萎病，田间防效达76.9%～84.6%。Vosatka等[19]用AMF()和同时接种草莓根际土壤，具有增效互作作用。本研究中室内筛选时两个菌株混合的WP处理，对草莓枯萎病的防效能够达到66.9%~77.2%，单菌株的防效只有53.9%~57.1%，而3个菌株混合的WP处理其防效可以达到83.2%，明显的高于单菌株和双菌株的处理。

另外，本研究在选择菌株混配的时候，前期进行了菌株与菌株间的亲和性测试，因为菌株之间的亲和与否对植物病害的防治效果有一定的影响。如菌株之间亲和性好，通常有协同增效作用，如菌株之间亲和性不好，容易引起药效不稳定[20]。陈志谊[21]研究了拮抗细菌菌株之间亲和性和生物防治效果之间的关系，结果显示菌株之间亲和性越好，其对病原菌的防治效果越佳。因此在生物防治的实际应用中，对不同的菌株进行亲和性测试，筛选出具有协同、增效作用的亲和性好的菌株，作为生防菌组合菌剂，具备使其较好的防治效果和生态适应性。

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Efficacy of the Formulation with CombinedStrains Against Strawberry Wilt

GAN Hua-lei, WANG Cheng-fang, HAO Wen-juan, YE Nai-wei, MAO Wei-li*

(Shanghai WLH Biotech Corp., Shanghai 200000, China)

A wettable powder (WP) formulation with single, 2 or 3 combined strains ofspp. (Tr14, Tr25, Tr85）was made and used for an indoor and field bioassays to test their efficacy on strawberry wilt caused byf. sp. fra-gariae. The results of the indoor bioassay showed that there were no significant differences in the incidence of the disease (, %) and the efficacy rate of disease control (, %) over the strawberry seedlings treated with 3 combined strains (Tr14+Tr25+Tr85, TM3) WP 200 T, 30% carbendazim WP 1 500 T and 2 combined strain (Tr14+Tr85) WP 200 T. However, they were significantly（≤0.05）lower (,%) or higher (,%), respectively, than those treated with single strain WP 200 T, other 2 combined strains WP 200 T and blank control. TM3 WP continued to be used for field efficacy trials in Shanghai, Beijing, Fujian and Chongqing in 2016 and 2017, respectively. The results showed that the values ofandof the strawberry seedlings treated with TM3 WP at 100 T, 200 T and 50% carbendazim WP 1 500 T were significantly（≤0.05）lower or higher, respectively, than those treated with TM3 WP 400 T, bacillus subtilis 1 000 T and blank control.

spp.;f.sp. fra-gariae; biological control; preventing efficacy

S476

A

2095-3704（2019）01-026-06

10.3969/j.issn.2095-3704.2019.01.05

2018-12-24

防治草莓多种病害新型微生物农药/菌肥的研发与应用（16391902400）

干华磊（1987—），男，农艺师，主要从事生物农药的研发与技术推广，hlgan1026@163.com；

毛伟力，博士，weilimao@hotmail. com。

干华磊, 王承芳, 郝文娟, 等. 复合木霉菌制剂防治草莓苗枯萎病的研究[J]. 生物灾害科学, 2019, 42(1): 26-31.