张倩榕，郑小璞，李冰，高登峰

流行病学调查显示，绝经后女性冠心病发病率明显升高，其原因与失去雌激素保护有关［1］。雌激素替代疗法（HRT）指对存在雌激素缺乏的绝经后妇女补充雌激素及孕激素以缓解其更年期症状的治疗。近年来研究发现，HRT对绝经早期女性心血管系统有益，但对绝经晚期或年龄＞60岁女性心血管系统无益甚至有害［2］。因此，有学者提出HRT的“时间窗假设”，即HRT仅在绝经后一定时间内对心血管系统有益［3］。动脉粥样硬化的特点是受累动脉病变从内膜开始，而一氧化氮（NO）对内皮细胞具有保护作用，是机体重要的内皮源性舒张因子，其在调节血管张力、抗动脉粥样硬化过程中具有重要作用；一氧化氮合酶（NOS）是催化合成NO的重要酶，内皮型一氧化氮合酶（eNOS）主要表达于血管内皮细胞和心肌细胞，eNOS功能障碍可导致血管舒缩功能紊乱，冠状动脉痉挛、血栓形成，进而促进冠心病发生发展。既往研究表明，雌激素可通过上调eNOS表达而促进NO生成，进而扩张血管［4-5］。本研究旨在探讨不同时期HRT对行卵巢切除术大鼠血管内皮功能的影响，以探索HRT存在“治疗时间窗”的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2017年4—7月，选取无特殊病原体（SPF）级健康SD雌性大鼠32只，月龄10～12个月，平均体质量（450±10）g，均购自西安交通大学医学部动物部。饲养条件：室温20～22 ℃，手术室温27～28 ℃，相对湿度55%～60%。

1.2 主要试剂及仪器 离体组织器官恒温灌流装置（成都态盟科技有限公司生产，型号：SV-8），电子天平（德国赛多利斯公司生产，型号：BP221s），高速离心机（上海安亭科学仪器厂生产，型号：TGL-16G），透射显微镜（日本日立公司生产，型号：7650），体视显微镜（海光学仪器厂生产，型号：XTZ-E），eNOS、NO试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司生产）。

1.3 实验方法 将SD大鼠依次编号，采用随机数字表法分为正常对照组、无卵巢组、早期干预组及晚期干预组，每组8只。正常对照组大鼠于1周后给予0.9%氯化钠溶液灌胃，1次/d；去卵巢组大鼠于卵巢切除术后1周开始给予0.9%氯化钠溶液灌胃，1次/d；早期干预组大鼠于卵巢切除术后1周开始行HRT，1次/d；晚期干预组大鼠于卵巢切除术后16周开始行HRT，1次/d，4组大鼠均干预8周。HRT方法：8粒炔雌醇环戊醚（CEE）（0.625 mg/粒）+8粒醋酸甲基孕酮（MPA）（2 mg/粒）溶于0.9%氯化钠溶液100 ml，相当于每2 ml液体中含0.1 mg CEE、0.32 mg MPA，每日灌胃容积=鼠体质量（g）/1 000×1.4。所有大鼠给予普通饲料并在统一环境下饲养，每周称重1次，根据大鼠体质量调整灌胃容积。

1.4 卵巢切除术模型制备 模型制备大鼠于术前晚20∶00禁食过夜，不禁水，称重，采用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，麻醉成功（肌肉松弛、角膜反射减弱、心跳呼吸平稳）后固定大鼠，背部备皮，安尔碘消毒，铺洞巾，取腰背部切口进入，找到腰椎两侧肾后方小球状卵巢，采用丝线结扎后切除，丝线双层缝合关腹［6］。术后第5天行阴道细胞涂片，如动情周期消失则证明模型制备成功［7-9］。

1.5 观察指标

1.5.1 血清NO、eNOS水平 各组大鼠均于最后1次灌胃后采用10 ml注射器于腹主动脉根部穿刺动脉，抽取血液，将2 ml血液注入不抗凝干燥玻璃试管中，静置30 min，血液凝固后3 000 r/min离心15 min（离心半径13.5 cm），分离血清并冻存于-20 ℃冰箱待测；采用硝酸还原酶法检测血清NO、eNOS水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5.2 血管环制备及血管环舒张度检测 抽取腹主动脉血后50 min内处死各组大鼠，取出胸主动脉，置于预冷的通有95%氧气（O2）和5%二氧化碳（CO2）的改良K-H液（NaCl 118.3 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、MgSO44.7 mmol/L、H2O 1.2 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、glucose 11.1 mmol/L）冰水浴中漂洗，小心剪去血管周围脂肪和结缔组织，清除血管内血液，采用眼科剪将血管剪成3～4 mm血管环。采用两根不锈钢微型挂钩贯穿血管环管腔，水平悬挂于盛有10 ml K-H液的器官浴管中，下方固定，上方用一细钢丝与张力换能器相连。浴管中持续通有95%O2+5%CO2的混合气体。调节最适前负荷至1.0 g，平衡90 min，期间更换K-H液，1次/15 min。待血管环稳定后将张力换能器系统调零，采用KCl（100 mmol/L）检测血管环反应性，待收缩反应曲线至平台期后冲洗3次后平衡20 min，张力基本恢复至基线，再次给予KCl（100 mmol/L），待收缩反应曲线至平台期，比较2次收缩幅度。之后再次冲洗3次后给予1 μmol/L去氧肾上腺素（PE）预收缩血管，达峰值约10 min后采用累积浓度法依次给予 1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L乙酰胆碱（ACh），观察血管张力变化。待累积反应稳定后冲洗3次，平衡至基线后，采用1 μmol/L PE再次收缩血管，血管收缩达峰值后采用累积浓度法依次给予 1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L硝普钠，观察血管张力变化。血管环舒张度以血管舒张张力占PE（1×10-6mol/L）引起收缩张力的百分比表示［10］。

1.6 统计学方法 应用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。以（双侧）P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清NO、eNOS水平 干预后4组大鼠血清NO、eNOS水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；去卵巢组和晚期干预组大鼠血清NO、eNOS水平低于正常对照组，早期干预组大鼠血清NO、eNOS水平高于去卵巢组和晚期干预组，晚期干预组大鼠血清NO、eNOS水平低于去卵巢组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

表1 4组大鼠干预后血清NO、eNOS水平比较（±s，μmol/L）Table 1 Comparison of serum levels of NO and eNOS in the four groups after intervention

表1 4组大鼠干预后血清NO、eNOS水平比较（±s，μmol/L）Table 1 Comparison of serum levels of NO and eNOS in the four groups after intervention

注：NO=一氧化氮，eNOS=内皮型一氧化氮合酶；与正常对照组比较，aP＜0.05；与去卵巢组比较，bP＜0.05；与早期干预组比较，cP＜0.05

组别 只数 NO eNOS正常对照组 8 38.30±5.55 2.59±0.16去卵巢组 8 28.99±8.20a 2.10±0.88a早期干预组 8 36.70±5.30b 3.08±0.18b晚期干预组 8 5.60±0.55abc 1.09±0.06abc F值 57.63 27.77 P值 ＜0.01 ＜0.01

2.2 血管环舒张度 干预后正常对照组大鼠血管环舒张度为（0.822±0.234）%，去卵巢组大鼠为（0.691±0.187）%，早期干预组大鼠为（0.890±0.074）%，晚期干预组大鼠为（0.756±0.146）%。4组大鼠血管环舒张度比较，差异有统计学意义（F=3.20，P=0.04）；去卵巢组大鼠血管环舒张度低于正常对照组，早期干预组和晚期干预组大鼠血管环舒张度高于去卵巢组，早期干预组大鼠血管环舒张度高于晚期干预组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

基础及临床试验证实，雌激素对心血管具有保护作用，因此绝经前女性冠心病发病率较低，围绝经期及绝经后女性冠心病发病率较高［1］。既往研究表明，雌激素缺乏是冠心病的独立危险因素之一［11-13］，女性绝经前心血管疾病发生年龄较男性约晚10年，绝经后随着雌激素水平降低，女性心血管疾病发生风险明显升高［14］。

既往研究表明，绝经后合并高胆固醇血症患者口服雌激素后纤溶酶原激活剂抑制剂1（PAI-1）和选择素E水平降低［15］；WINGROVE等［16］研究表明，17β-雌二醇和雌激素可以抑制正常人冠状动脉内皮细胞（CAEC）刺激内皮素1释放的能力及eNOS表达能力。KOH等［17］研究表明，HRT能有效抑制纤维蛋白溶解及减少血管炎性标志物生成，故对心血管系统有益。此外，雌激素还可不依赖内皮细胞发挥作用，而是通过Ca2+通道促进血管舒张。KOH等［18］研究表明，Ca2+浓度增加可导致动脉环收缩，而增加雌二醇可以抑制动脉环收缩。既往研究还表明，雌二醇可抑制心肌细胞Ca2+内流，进而减少细胞内游离Ca2+［19］；同时，雌激素可以作用于BKCa通道而松弛冠状动脉［20］。但有大型随机双盲对照试验并不推荐HRT作为冠心病的一级预防药物［21］。LEE等［22］研究结果显示，绝经后一定时期内行HRT者冠心病发生概率明显低于绝经后较长时间行HRT者，推测绝经后一定时间内雌激素具有心血管保护作用，即雌激素“治疗时间窗”，但具体机制尚不明确。笔者所在课题组提出假设，女性随着绝经时间延长其衰老及体内激素环境改变（如雌激素水平低下）导致雌激素受体表达、机体炎性反应相关因子活化受影响，雌激素在特定组织中的作用通路发生改变，进而导致机体免疫、血管等组织中eNOS、NO含量较低而无法有效维持血管内皮功能。

本研究通过制备卵巢切除术模型大鼠模拟女性绝经后状态，并探讨不同时期HRT对大鼠血管内皮功能的影响，结果显示，干预后去卵巢组和晚期干预组大鼠血清NO、eNOS水平低于正常对照组，早期干预组大鼠血清NO、eNOS水平高于去卵巢组和晚期干预组，晚期干预组大鼠血清NO、eNOS水平低于去卵巢组；干预后去卵巢组大鼠血管环舒张度低于正常对照组，早期干预组和晚期干预组大鼠血管环舒张度高于去卵巢组，早期干预组大鼠血管环舒张度高于晚期干预组，提示早期HRT对卵巢切除术后大鼠血管内皮功能具有一定保护作用，而晚期HRT对卵巢切除术后大鼠血管内皮功能无保护作用，即HRT存在“治疗时间窗”。

综上所述，早期HRT对卵巢切除术后大鼠血管内皮功能具有一定保护作用，而晚期HRT对卵巢切除术后大鼠血管内皮功能无保护作用。本研究仍存在以下不足：（1）大鼠月龄为10～12个月，不能排除老龄对心血管的影响［23］；（2）由于研究经费及时间原因而未深入探讨HRT存在“治疗时间窗”的机制；（3）雌激素使用剂量及具体时间尚有待进一步研究。

作者贡献：张倩榕、郑小璞进行文章的构思与设计；张倩榕、李冰进行数据收集、整理、分析；张倩榕进行结果分析与解释，负责撰写论文；李冰负责文章的质量控制及审校；高登峰对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。