王洁 马委委 司晨琛 周炳荣 骆丹

[摘要]目的：探讨miR-4655-3p在中波紫外线旁观者效应中的作用。方法：使用miR-4655-3p 抑制剂（inhibitor）或其对应的阴性对照（negative control，NC）转染人皮肤成纤维细胞（HSFs）后，对不同组HSFs进行UVB（60mJ/cm2）单次照射，照光后24h取细胞培养上清液与正常HSFs共孵育48h，分别测定细胞增值率、氧化损伤水平及凋亡率。结果：inhibitor转染组细胞中miR-4655-3p相对表达量较NC转染组明显降低（P<0.05）;照光后，inhibitor转染组细胞、细胞培养上清液及该上清液孵育的HSFs中miR-4655-3p的相对表达量较NC转染组显著降低（P<0.05）;与NC组旁观者细胞相比，Inhibitor组旁观者细胞的增殖率增加，氧化损伤水平及凋亡率减少，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：miR-4655-3p在中波紫外线旁观者效应中发挥作用，抑制其表达可在一定程度上减弱紫外线旁观者效应。

[关键词]miRNA;成纤维细胞;紫外线;旁观者效应;氧化损伤;凋亡

[中图分类号]R329.2    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2019）04-0068-03

Abstract： Objective  To investigate the role of miR-4655-3p in UVB-radiation induced bystander effects（UVB-RIBE）. Methods  HSFs transfected with miR-4655-3p inhibitor or NC were exposed to 60mJ/cm2 single UVB radiation. 24h after UVB radiation， the supernatant were transfered to normal HSFs and remained for 48h. Subsequently， cell proliferation rate， oxidative damage and apoptosis rate of recipient cells were measured. Results  The relative expression of miR-4655-3p in the inhibitor transfected cells were lower than the NC transfected cells. After UVB radiation， the relative expression of miR-4655-3p in the inhibitor transfected cells， their supernatant and the supernatant cultured bystander cells were lower than the corresponding NC transfected groups. The cell proliferation rate of bystander cells from inhibitor group was higher than bystander cells from NC group. Besides， the oxidative damage and apoptosis rate of bystander cells from inhibitor group was lower than bystander cells from NC group. All the data were statistically significant（P<0.05）. Conclusion  miR-4655-3p plays a role in UVB bystander effect. The down-regulation of miR-4655-3p inhibits UVB bystander effect to some extent.

Key words： miRNA; fibroblasts; ultraviolet; bystander effects; oxidative damage; apoptosis

日光紫外线是造成皮肤光老化的重要因素，长期暴露于紫外线下会引起皮肤中多种细胞结构及功能发生变化。目前认为紫外线旁观者效应在紫外线不良反应的病理进展中发挥了重要作用。紫外线旁观者效应是指未受辐射细胞发生与直接受辐射细胞类似的光损伤反应，包括氧化损伤、基因突变、基因组不稳定，细胞凋亡等[1]。研究表明，旁观者效应由细胞间间隙连接和分泌因子构成的细胞间通讯引起[2]。笔者先前的实验通过使用基因芯片和实时定量PCR鉴定了中波紫外线辐射后差异表达的miRNA，发现miR-4655-3p在受照射的细胞、辐射细胞培养上清液中及其上清液培养的细胞中表达显著升高。鉴于已有部分miRNA被证明在旁观者效应中扮演着重要角色[3-4]，笔者推断miR-4655-3p在紫外线旁观者效应中发挥一定作用。本实验通过使用miR-4655-3p抑制剂下调中波紫外线照射后miR-4655-3p的表达，进一步研究miR-4655-3p在紫外线辐射旁观者效应中的作用。

1  材料和方法

1.1 HSFs的分離与培养：取健康成年男性的包皮组织，将包皮置于碘伏中浸泡6min。使用含10%青-链霉素的PBS溶液，快速反复冲洗包皮组织至无血迹，使用眼科剪仔细剪去皮下组织后加入适量0.25% Dispase酶消化液，并在4℃冰箱中消化18h。分离表、真皮组织后取真皮部分，加入适量0.1%胶原酶I消化液，并在37℃培养箱中消化2h。加入等量含10%胎牛血清（杭州四季青公司）及1%青-链霉素的DMEM培养基（美国Hyclone公司）终止反应。使用200目尼龙网过滤，过滤液在1 500rpm下离心5min，弃上清，加入全培并轻轻吹打混匀，转移至25cm2培养瓶中，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

1.2 细胞处理：HSFs于处理前1d以50%的密度均匀种植于6孔板中。转染试剂、miR-4655-3p inhibitor及inhibitor阴性对照购于广州锐博生物科技有限公司，根据说明书配制100nM的转染混合液，并在室温下放置10min。小心将转染混合液滴入细胞培养上清中，放入培养箱中培养。24h后刷新培养基并对细胞进行单次60mJ/cm2 UVB照射，继续于培养箱中培养24h。将此细胞培养上清加入正常HSFs中培养48h。

1.3 实时定量PCR：使用Trizol试剂（美国Invitrogen公司）提取总RNA。用茎环法进行miRNA逆转录，U6作为miRNA的内参。使用TB Green嵌合荧光试剂（日本TaKaRa公司）进行实时定量PCR反应。PCR程序使用StepOnePlusTM实时PCR系统，用2-△△Ct值比较分析数据。

1.4 细胞增殖率测定：96孔板中的细胞用转染细胞上清培养48h后，去除上清并用PBS清洗3遍。每孔中加入100?l培养基与10?l CCK8溶液（日本Dojindo公司）并混匀。在培养箱中避光孵育1.5h后使用酶标仪测定450nm处的吸光度。

1.5 氧化损伤水平测定：6孔板中的细胞用转染细胞上清培养48h后，去除上清并用PBS清洗3遍。按照1：500的比例用裸培稀释DCFH-DA（上海碧云天生物技术有限公司），每孔中加入1ml混合液，于培养箱中避光孵育20min。用裸培洗涤3次后使用荧光显微镜观察，或收集细胞后使用流式细胞仪检测DCF荧光强度。

1.6 细胞凋亡率检测：6孔板中的细胞用转染细胞上清培养48h后，去除细胞上清并用PBS清洗3遍。收集细胞用200?l缓冲液重悬，加入3?l Annexin V-FITC及3?l PI后轻柔涡旋混匀，室温避光孵育10min后，使用流式细胞仪检测。

1.7 统计学分析：使用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，所有实验重复至少3次，数据以平均值±标准差（x?±s）表示，行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 inhibitor转染下调UVB照射后miR-4655-3p的表达：inhibitor转染细胞miR-4655-3p相对表达量（0.5279±0.031）显著低于NC转染组（1.0±0.1）;细胞转染后照光并培养24h后，inhibitor转染组细胞中（0.4400±0.079）及上清液中（0.3295±0.044）miR-4655-3p的相对表达量较NC转染组（1.0±0.1）显著降低;inhibitor转染组上清液培养48h后，旁观者细胞中miR-4655-3p的相对表达量（0.5664±0.072）较NC组上清液培养的旁观者细胞（1.0±0.1）显著降低。以上差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.2 miR-4655-3p的下调对旁观者细胞增殖率的影响：使用OD值表示细胞增殖水平，inhibitor组旁观者细胞的增殖率（0.8697±0.016）高于NC组旁观者细胞（0.7911±0.012），差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 miR-4655-3p的下调对旁观者细胞氧化损伤水平的影响：使用荧光显微镜观察，可见inhibitor组旁观者细胞的荧光亮度低于NC组旁观者细胞。使用流式细胞仪检测DCF平均荧光强度，inhibitor组旁观者细胞的荧光强度（112.5±13.44）显著低于NC组旁观者细胞（171.9±7.38），差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4 miR-4655-3p的下调对旁观者细胞凋亡水平的影响：流式细胞仪检测细胞凋亡率，inhibitor组旁观者细胞的凋亡率（14.82±2.54）较NC组旁观者细胞（27.70±1.97）减弱，差异有统计学意义（P<0.05）。

3  讨论

旁观者效应是一种已经被充分证明的现象，其中由辐射引起的部分称为辐射诱导的旁观者效应。目前研究证明，辐射诱导的旁观者效应由辐射细胞与旁观者细胞之间的细胞间通讯引起，这种通信方式包括细胞间连接及可溶性因子等。

miRNA是一种长约22个核苷酸的非编码RNA，通过与靶mRNA的3'-非翻译区结合调节其表达[5]。据报道，miRNA可参与许多生理和病理过程，包括细胞周期、免疫反应、生物代谢，致癌作用等[6]。最近，miRNA已被证明是参与旁观者效应的潜在介质[3-4]。Tian等[7]人研究认为miR-21通过调节SOD2促进了α照射的HaCaT角质形成细胞诱导的旁观者效应。然而Hu等[8]人证实miR-663通过反馈模式靶向TGF-β1抑制辐射诱导的旁观者效应。这些研究暗示miRNA在旁观者效应中发挥作用，且这些作用是多方面的，需要进一步研究单个miRNA在旁观者效应中的功能及其作用于旁观者细胞的途径。作为RNA的一种，miRNA易被RNA酶降解，细胞外miRNA通过结合高密度脂蛋白[9]，与Ago2形成蛋白质复合物[10]或被包装到细胞外囊泡中[11]而避免被降解，这些miRNA统称为分泌型miRNA。其中，由于具有特异性转运到靶细胞的能力，外泌体miRNA的功能得到了很多关注。已经报道了其在多方面的功能，例如参与肿瘤的发生[12]，在疾病中发挥促进或保护作用[13-14]并充当临床生物标志物[15]。

本课题组前期实验使用基因芯片篩选出了许多中波紫外线辐射细胞中差异表达的miRNA。通过进一步检测辐射细胞培养上清液中miRNA表达，发现了一些与辐射细胞中呈现相同表达趋势的miRNA，其中miR-4655-3p表达显著增高。使用辐射细胞培养上清液孵育正常HSFs，出现类似直接受辐射细胞的光损伤效应，说明这些上清液中有引起旁观者效应的介质。结合既往关于miRNA及旁观者效应间的研究，笔者推测miR-4655-3p是起作用的介质之一。本实验使用inhibitor下调UVB辐射后的miR-4655-3p表达，发现抑制miR-4655-3p后，旁观者细胞的光损伤效应在一定程度上减弱。这些结果表明UVB辐射过后，miR-4655-3p的升高促进了紫外线旁观者效应。

本文虽然证明了miR-4655-3p在旁观者效应中起促进作用，但不足之处在于并未阐明miR-4655-3p在细胞间转移的具体机制及其引起旁观者效应的分子机理。同时，有研究强调了miRNA之间的相互作用[16]，这不禁让笔者思考，紫外线旁觀者效应的机制中是否也存在类似作用，这些问题都有待于进一步的研究及探讨。随着对miRNA和紫外线旁观者效应的进一步了解，这些研究可能为紫外线防护和紫外线相关疾病的治疗提供新的见解。

[参考文献]

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[收稿日期]2019-01-05