白秀萍，董玉杰

（1.淄博市食品药品检验研究院，山东 淄博 255086；2.山东金城生物药业有限公司，山东 淄博 255000）

氢化可的松为肾上腺皮质激素类的典型代表药物，可调节糖、脂肪和蛋白质的生物合成及代谢，具有抗炎、抗毒、抗休克及抗过敏等药理作用，既可作为糖皮质激素使用，也可作为制备其它甾体激素药物的起始化合物[1]。目前国内氢化可的松的制备均采用半合成方法，工艺中使用甲醇、氯仿、1,2-二氯乙烷等有机溶剂，限值见表1。为保证产品安全，本文依据中国药典2015年版四部及相关文献[2-3]建立了测定残留溶剂甲醇、氯仿、1,2-二氯乙烷残留量的气相色谱法。

表1 氢化可的松残留溶剂限度表

1 仪器与试药

6890N 气相色谱仪（配FID检测器，Agilent G1888 顶空进样器，20 ml顶空瓶，美国Agilent）；氢化可的松（批号：0905034，0905035，0905045，0905046，山东新华）；甲醇（分析纯，天津四友），氯仿（分析纯，国药集团），1,2-二氯乙烷（分析纯，莱阳经济技术开发区精细化工厂），二甲基亚砜（分析纯，天津福晨）。

2 方法与结果

2.1 供试液制备

2.1.1 空白溶液制备 精密量取二甲基亚砜1.0 ml置入20 ml顶空瓶，密封，待用。

2.1.2 标准贮备溶液制备 标准贮备溶液A：精密称取无水甲醇0.2 g（约0.25 ml）、氯仿10 mg（约7 μl）、1,2-二氯乙烷10 mg（约7 μl）置入已加入少量二甲基亚砜的100 ml量瓶溶解，用二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀得A液。

标准贮备溶液B：取5.0 ml标准贮备溶液A，用二甲基亚砜稀释至100 ml，混合均匀。

2.1.3 标准溶液制备 精密量取标准贮备溶液B 1.0 ml置入20 ml顶空瓶，密封，混合均匀，同法配制6份。

2.1.4 样品溶液的制备 精密称取样品约0.1 g置入20 ml顶空瓶，加入1.0 ml二甲基亚砜溶解，密封。每批样品制备2份。

2.1.5 样品空白溶液制备 取样品（批号：0905034），研细，充分干燥，将其中残留溶剂降至较低的水平，作为样品空白。称取样品空白约0.10 g，精密称定，置入20 ml顶空瓶，精密加入二甲基亚砜1.0 ml溶解，密封，混合均匀。

2.2 仪器条件

毛细管色谱柱DB-624（30 m×0.53 mm，3.0 μm）；柱温：初始温度40 ℃，保温10 min，以60 ℃/min升至200 ℃保持3 min；进样口温度：140 ℃；检测器温度：250 ℃；载气：N2；载气流速：5 ml/min；分流进样，分流比（1:1）；平衡温度：120 ℃；平衡时间：30 min；针温：130 ℃；Transfer line 温度：140 ℃；加压时间：0.5 min；进样体积：1.0 ml。

2.3 计算方法

将空白溶液、标准溶液和样品溶液，依次置入顶空进样器，120 ℃下平衡30 min。取空白溶液进样，记录图谱，在标准溶液和供试溶液中扣除溶剂峰。取标准溶液进样。溶剂出峰顺序依次为甲醇、氯仿、1,2-二氯乙烷。相邻组分之间的分离度R，应不小于1.5；取6份标准溶液，连续进样，以3种溶剂峰面积计算的RSD，均应不大于15.0%。取每个供试溶液进样，各进样1次，记录图谱。计算公式如下。

注：X：残留甲醇、 氯仿、1,2-二氯乙烷的量（ppm）；Ai：供试溶液的图谱中溶剂(i)的峰面积；A0：空白溶液的图谱中相应溶剂(i)的峰面积；Asi：标准溶液的图谱中溶剂(i)的峰面积；W：样品的称量（g）；Wsi：每个溶剂的称重（g）。

2.4 专属性试验

取空白溶液进样，分析溶剂（二甲基亚砜）对检测的影响；取样品空白溶液进样，分析样品对检测的影响；分别取甲醇、氯仿、1,2-二氯乙烷各1 μl置入已加入1.0 ml二甲基亚砜的顶空瓶，密封，混合均匀，再分别进样，记录各溶剂的保留时间，用于各个溶剂峰的定性；取标准溶液进样，并记录各溶剂出峰顺序、保留时间，计算相邻溶剂峰的分离度R，判断各溶剂之间无干扰，则各相邻溶剂之间分离度R均应大于1.5；取样品空白0.10 g加入标准溶液1.0 ml溶解，再进样，若判断样品空白对残留溶剂分离度无影响，则各相邻溶剂峰的分离度R均应大于1.5，且与未加入样品时所得分离度无明显差异。

结论：标准溶液中出峰顺序依次为甲醇、氯仿、1,2-二氯乙烷；保留时间依次为1.939，6.442，8.017 min；空白溶液在各溶剂出峰时间均无干扰峰，溶剂（二甲基亚砜）对检测无影响；样品空白在各溶剂出峰时间均干扰峰，样品对检测无影响；分离度R甲醇-氯仿=24.3，R氯仿-1,2-二氯乙烷=6.2，均大于1.5，加入样品对分离度无明显影响，专属性符合要求。

图1 专属性试验色谱图

2.5 系统适用性试验

称取甲醇0.1932 g、氯仿0.0105 g、1,2-二氯乙烷0.0100 g，按照方法描述配制标准溶液6份，连续进样。计算待测溶剂的理论塔板数N；连续进样6次，计算峰面积RSD。标准溶液中甲醇、氯仿、1,2-二氯乙烷的理论塔板数依次为3406，9063，11583；峰面积RSD依次为1.3%，2.3%和1.9%,均小于15.0%。方法系统适用性试验符合验证标准。

2.6 精密度试验

按照2.5 项下系统适用性试验数据，以每个溶剂峰面积的RSD评价方法的重复性，标准溶液重复进样6次，甲醇、氯仿和1,2-二氯乙烷峰面积RSD（n=6）分别为1.3%，2.3%和1.9%，均小于15.0%，方法的精密度良好。

2.7 线性关系试验

1,2-二氯乙烷标准贮备液：精密称取1,2-二氯乙烷0.0201 g置入已加入一定量二甲基亚砜的10 ml量瓶，用二甲基亚砜稀释至刻度，混合均匀。

标准贮备溶液A：精密称取甲醇0.3960 g、氯仿0.0246 g置入已加入一定量二甲基亚砜的100 ml量瓶，再加入1,2-二氯乙烷标准贮备液1.0 ml，用二甲基亚砜稀释至刻度，混合均匀。取标准贮备溶液A 0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml分别置入100 ml量瓶，用二甲基亚砜稀释至刻度，混合均匀，得到系列浓度标准贮备溶液。

系列浓度标准溶液：从低浓度到高浓度，依次取系列浓度标准贮备溶液各 1.0 ml置入20 ml顶空瓶，密封，混合均匀，得到系列浓度标准溶液。每个溶液制备3份。

分别取上述系列浓度标准溶液，120 ℃平衡30 min，分别进样。以标准溶液中甲醇、氯仿和1,2-二氯乙烷的峰面积对其质量（以µg计,等于浓度×1.0 ml），使用Origin 5.0软件进行线性回归，得到每个溶剂标准曲线，线性方程及相关系数R。结果表明：甲醇在99～1188 ppm浓度范围内，线性方程为Y=7.718+8.861X，R=0.9999；氯仿在12.3～73.8 ppm浓度范围内，线性方程为Y=3.094X-0.153，R=0.9987；1,2-二氯乙烷在1.005～6.03 ppm浓度范围内，线性方程为Y=8.472X-0.080，R=0.9963。表明峰面积与浓度均呈良好线性关系。

2.8 准确度和回收率试验

样品空白的制备：取样品（批号：0905034），研细，充分干燥，将其中残留溶剂降至较低的水平。称取样品空白0.10 g，精密称定，置入20 ml顶空瓶，精密加入二甲基亚砜 1.0 ml溶解，密封，混合均匀得样品空白溶液。取2.7项下的No.2、No.6、No.7标准贮备溶液。标准溶液 取系统适应性试验项下的数据进行计算。

取20 ml顶空瓶9个，分为3组，每组3个，各精密称取样品空白0.10 g。分别取线性项下No.2，No.6，No.7标准贮备溶液各1.0 ml,分别加入到每组顶空瓶中，使溶解，密封，混合均匀，得到相当于限度20%，100%，120%测试溶液，测定。

计算方法 计算每个溶剂每个浓度的回收率，方法的回收率以3个浓度测定的回收率的平均值评价。计算公式如下。

注：Ai：测试溶液图谱中溶剂(i)的峰面积；A01：溶剂空白图谱中溶剂(i)的峰面积；A02：样品空白图谱中溶剂(i)的峰面积；ASi：标准溶液图谱中溶剂(i)的平均峰面积；Ci：测试溶液中溶剂(i)的加入量，µg；CSi：标准溶液中溶剂(i)的量，µg。

表2 回收率试验结果（n=3）

以每个溶剂的回收率评价方法的准确度。结果见表2。甲醇、氯仿和1,2-二氯乙烷的回收率分别为98.5%，95.0%和98.1%，回收率的RSD分别为2.3%，2.5%和2.6%；每个溶剂的回收率均介于90.0%～110.0%，方法准确度良好。

2.9 检测限和定量限

取线性测试项下标准溶液逐步用溶剂稀释，得到适当浓度的溶液。在色谱系统下，分别进样，当待测组分的信噪比为2～3倍时，对应的浓度为该组分的最小检测浓度；当待测组分的信噪比为10～20倍时，对应的浓度为该组分的最小定量浓度。甲醇、氯仿和1,2-二氯乙烷的检测限分别为0.5 ppm，0.5 ppm和0.2 ppm，定量限分别为2 ppm，2.5 ppm和0.9 ppm。

2.10 耐用性

分别由两名化验员（化验员1和化验员2），使用两支同型号，不同色谱柱，改变色谱条件，柱温提高和降低5%，流速提高和降低5%，分别进行系统适用性验证。结果见表3。

表3 耐用性实验结果

计算各溶剂峰面积的RSD（n＝6），以RSD评价方法的耐用性。结果表明，不同化验员用使用不同色谱柱；提高和降低柱温，提高和降低流速，连续进样6针，RSD均小于15.0%，表明方法的耐用性良好。

3 样品检测

取4批氢化可的松样品（批号：0905034，0905035，0905045，0905046），按照规定条件检测。结果见表4。

表4 样品检测结果

4 结论

本文参考中国药典2015年版四部及相关文献，采用气相色谱顶空进样法测定氢化可的松中甲醇、氯仿、1,2-二氯乙烷溶剂残留，考察了仪器条件、方法学研究，线性、准确度、精密度等均满足要求，建立了测定溶剂残留的检测方法，对4批样品进行测定。表明该法灵敏度高、精密度好，可用于氢化可的松中甲醇、氯仿、1,2-二氯乙烷溶剂残留的测定。