潘 勇 贾贵清 王 凯

(四川省人民医院胃肠外科,成都610072)

直肠癌属于现代日常生活中较为常见的一类消化道恶性肿瘤[1]。随着人们生活水平的提高和饮食习惯的改变，近些年来的研究多有发现，结肠癌发病率及死亡率每年均呈现上升的趋势，严重威胁着人类生活质量和身体健康[2，3]。癌症的增殖和侵袭在结肠癌患者发病过程中占有重要的地位，但就目前的研究而言，关于直肠癌增殖和侵袭的机制尚未完全了解。miRNAs在体内参与诸如细胞应激、增殖、凋亡、脂肪代谢生物过程的信号通路调控，对肿瘤发生发展作用重大[4，5]。miR-21 是一种较为广泛存在的miRNA，因在多种肿瘤组织中高表达，成为探讨miRNA 在肿瘤发生、发展中研究的热点之一[6，7]。本文通过在直肠癌HT-29细胞系中研究AS-miR-21对直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响，来探讨其生理功能。

1 材料与方法

1.1材料 直肠癌HT29细胞株(上海赛默生物科技发展有限公司)、RPMI1640培养液(杭州吉诺生物医药技术有限公司)、胰蛋白酶(美国赛默飞公司)、Lipofectamine®2000 Transfection Reagent(美国Invitrogen公司)、TaqMan®MicroRNA Reverse Trans-cription kit试剂盒(美国ABI公司)、白介素6试剂盒(美国赛默飞公司)、氯仿、异丙醇、酒精、结晶紫均为色谱纯，均购于天津化工试剂厂。LightCycler 480高通量实时荧光定量PCR仪(美国罗氏公司)、YCP-50型培养箱(长沙华曦电子科技有限公司)、3-18KS型离心机(美国Sigma公司)、CX31型奥林巴斯显微镜(日本OLYMPUS公司)、96孔板和24孔板均购自上海晶安生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与转染 细胞复苏：首先取出冻存直肠癌HT29细胞株，迅速放置于37℃水浴锅中融化，然后室温低速1 000 r/min离心3 min，弃去上清，加入1 ml含有10% FBS的RPMI1640培养液将细胞重悬，然后置于培养皿中，放入含有5% CO2的37℃培养箱进行培养，当生长至合适的细胞密度(70%至80%)时，对其进行传代培养。

细胞转染：其中AS-miR-21 (5′-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3′)以及无义序列(5′-AAGGCAAGCUGACCCUGAAGU-3′)均在生工生物进行合成，细胞转染严格按照Invitrogen公司的Lipofecta-mine®2000 Transfection Reagent说明书进行操作，空白对照组不进行转染，阴性对照组转染miR-NC。

1.2.2细胞RNA提取 对转染24 h后的直肠癌HT29细胞经0.25%的胰酶进行消化，收集消化后的细胞悬液于15 ml离心管中；进行4 ℃低速(1 000 r/min)离心2 min，弃去上清，置于冰上；加入1 ml Trizol裂解液，重悬并混匀细胞，置于冰上；向Trizol裂解液中加入200 μl氯仿，剧烈震荡细胞悬液，室温放置5～10 min，然后4℃离心15 min(2 000 r/min)；离心之后取上层置于RNase-free离心管(1.5 ml)，添加等体积异丙醇，充分震荡混匀后，于冰上放置30～40 min；取出离心管，然后4℃离心15 min(12 000 r/min)，得到RNA沉淀；采用500 μl，75%的酒精对RNA沉淀进行两次的洗涤，而后风干；加入50 μl RNase-free的水，室温溶解RNA；采用NanoDrop对总抽提的RNA进行浓度的测定，而后置于-20℃备用。

1.2.3miRNA的反转录与定量PCR检测 按照ABI公司的TaqMan®MicroRNA Reverse Transcrip-tion kit试剂盒操作说明书，对抽提的RNA进行体外反转录实验，得到cDNA产物；反应条件为：16℃，孵育30 min，42℃孵育30 min，85℃加热5 min，4℃保存。以得到的cDNA为模版，进行荧光定量PCR，采用TaqMan®Universal PCR Master Mix 20 μl反应体系，在罗氏LightCycler480仪器上操作，以U6作为表达检测的内参，ΔCT 表示miR-21的相对表达，其中ΔCT=|CTmiR-21-CTU6|；反应条件为：95℃，预变性10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，70℃ 30 s进行40个循环的扩增。

1.2.4CCK8检测细胞增殖活力 采用CCK-8方法检测HT-29细胞增殖能力，将转染24 h后的HT29细胞分别以5 × 103细胞/每孔接种于96孔板中，在37℃ 5%CO2的培养箱中继续培养，当细胞生长到24、48和72 h时，每孔中分别加入10 μl CCK-8溶液，放入培养箱孵育30 min后，使用酶标读数仪检测细胞在450 nm 处的吸光度值。

1.2.5细胞划痕实验 取各转染组HT29细胞106个接种至6孔板中，置于37℃ 5%CO2培养箱过夜培养直至细胞密度达到90%以上；采用无菌枪头在培养皿中均匀的进行划痕，然后采用1×PBS对细胞洗涤3次，加入培养基后显微镜下拍照，即为0 h时细胞迁移情况；继续置于37℃ 5%CO2培养箱进行培养，24 h后显微镜下拍照，记录两次拍照之间的划痕距离，重复6次实验，以迁移的平均距离反映各组直肠癌细胞的迁移能力。

1.2.6Transwell小室侵袭检测 在Transwell小室基膜上铺设基质胶，将小室至于24孔板，室温静止5～10 min；将转染后的细胞接种于小室上，小室中接种的细胞数量为5×104个/ml；然后将孔板至于37℃ 5%CO2的培养箱中孵育24 h；取出Transwell小室置于室温，并擦拭小室基膜表面细胞后，用95%的酒精固定15 min，之后再用0.1%结晶紫染色20 min，用双蒸水清洗后并拍照，记录每组发生侵袭的细胞数量，其中每组实验重复6次。

1.2.7白介素6的检测 采用酶联免疫法对癌细胞培养上清中IL-6浓度进行检测： IL-6单抗包被于酶标板上，血清中的 IL-6与单抗结合；加入生物素标记IL-6二抗，在酶标板上形成抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物；加入显色液进行显色处理；用酶标仪测量在450nm 波长下的吸光度值，通过绘制标准曲线计算血浆中IL-6浓度。具体操作步骤如下：浓缩洗涤液用蒸馏水稀释，混匀后备用；将标准品进行稀释，并得到 200 pg/ml的高浓度标准品，然后依次稀释为：100、50、25、12.5、6.25、3.13、0 pg/ml；在酶标板上加入 100 μl标准品及待测样品，每个样品加一个孔；混匀后封住板孔，室温孵育2 h；去除酶标板内液体，并洗涤反应板(每孔内加入 300 μl洗涤液)，每次洗涤后完全去除液体，反复洗涤3次；每孔加入 100 μl IL-6抗体生物素液，混匀后室温孵育1 h；去除酶标板内液体，并洗涤反应板(每孔内加入300 μl 洗涤液)，每次洗涤后完全去除液体，反复洗涤3次；每孔加入 100 μl酶联结合液，混匀后室温孵育30 min；去除酶标板内液体，并洗涤反应板(每孔内加入 300 μl洗涤液)，每次洗涤后完全去除液体，反复洗涤3次；每孔加入 100 μl显色液，混匀后室温孵育30 min；反应完成后，在每孔中加入 50 μl终止液，混匀，在450 nm 波长的酶标仪上读取吸光度值；以浓度为Y轴，吸光度为X轴，绘制标准曲线；将待测样本的吸光度带入标准曲线对应的方程中，计算待测样本的浓度。

2 结果

2.1各组HT29细胞中miR-21表达水平比较 通过定量PCR检测各转染组细胞中miR-21的相对表达量发现，在AS-miR-21组中miR-21的表达显著降低，平均为(2.42±0.27)ΔCT，而阴性对照组中miR-21的表达平均为(3.24±0.32)ΔCT，空白对照组中miR-21的表达平均为(3.19±0.48)ΔCT，相比于AS-miR-21组差异均有统计学意义(t=4.797，P=0.001；t=3.425，P=0.007)，见表1。

表1 各组细胞中miR-21表达水平比较

Note：1)P<0.05， compared to AS-miR-21 group.

图1 AS-miR-21对HT29细胞增殖活性的影响Fig.1 Effect of AS-miR-21 on proliferation activity of HT29 cellsNote: *.P<0.05，* *.P<0.01.

2.2AS-miR-21对HT29细胞增殖活性的影响 转染24、48、72 h后检测各组细胞OD450 nm吸光值发现，AS-miR-21组的增殖活性在转染24 h后显著下降，与阴性对照组以及空白对照组差异有统计学意义(F=4.588，P=0.028)，并且在48、72 h后增殖率均低于阴性对照组，差异有统计学意义(F=22.83,P<0.001；F=31.09,P<0.001)，见图1。

2.3AS-miR-21对HT29细胞迁移能力的影响 细胞划痕实验结果显示，AS-miR-21组HT29细胞迁移距离平均为(61.5±6.2)μm，相比于阴性对照组HT29细胞迁移平均距离为(97.6±9.7)μm，差异有统计学意义(t=7.681，P<0.05)。相比于空白对照组HT29细胞迁移平均距离为(101.3±9.2)μm，差异有统计学意义(t=8.787，P<0.05)，而阴性对照组HT29细胞迁移与空白对照组HT29细胞迁移平均距离相比，差异无统计学意义(t=0.680，P=0.513)，见图2。

2.4AS-miR-21对HT29细胞侵袭能力的影响 Transwell小室实验表明，转染AS-miR-21组HT29细胞侵袭数目平均为(17.5±3.8)个，阴性对照组HT29细胞侵袭数目平均为(56.5±9.8)个，空白对照组HT29细胞侵袭数目平均为(59.7±11.2)个。三组HT29细胞侵袭数目相比，差异有统计学意义(F=42.12，P<0.05)，其中AS-miR-21组HT29细胞侵袭数目显著低于阴性对照组，差异有统计学意义(t=9.089，P<0.05)，AS-miR-21组HT29细胞侵袭数目也显著低于空白对照组，差异有统计学意义(t=8.740，P<0.05)，见图3。

图2 不同组细胞迁移能力的比较(×200)Fig.2 Comparison of cell migration ability in different groups (×200)

图3 不同组HT29细胞侵袭能力的比较(×200)Fig.3 Comparison of invasive ability of HT29 cells in different groups (×200)

表2 各组细胞IL-6浓度的比较

Note：1)P<0.05， compared to AS-miR-21 group.

2.5AS-miR-21对HT29细胞IL-6表达的影响 在AS-miR-21组中IL-6的浓度显著降低，平均为(21.33±5.86)pg/ml，而阴性对照组中IL6的浓度平均为(58.62±10.43)pg/ml，空白对照组中miR-21的表达平均为(63.21±11.24)pg/ml，相比与AS-miR-21组差异均有统计学意义(t=7.635，P<0.05；t=8.093，P<0.05)，见表2。

3 讨论

直肠癌的发病率和死亡率均在国内外有上升趋势，是临床上最常见的恶性肿瘤之一，其出现化疗耐药及侵袭转移为预后差的主因[8]，严重威胁着人类的生命安全。直肠癌发病具有隐匿性，多数直肠癌患者确诊时已为晚期，其侵袭转移机制与多种癌基因及抑癌基因的异常表达相关[9]。以放化疗为主的综合治疗疗效欠佳，探索新的治疗方案提高结肠癌患者生存质量是目前研究关注热点[10]。恶性肿瘤组织最明显的生物学特性为肿瘤细胞的增殖、侵袭，如何有效抑制恶性肿瘤增殖和侵袭能力对病情控制及提高生存期意义重大[9-10]。

肿瘤的增殖与侵袭与诸多因素密切相关，miRNA 对肿瘤增殖和侵袭相关基因表达的调控作用是目前研究的热点，miRNA-34、miRNA-21、miRNA-143、miRNA-198、miRNA-224等均与直肠癌的发生发展密切相关，其中miRNA-21 是目前研究最广泛的miRNA，在结直肠癌中存在高水平表达[11-13]。Yamamichi等[14]对34 例手术切除的直肠癌与39 例内镜下切除的进展期结直肠癌采用核酸原位杂交发现从癌前息肉到癌症早期miRNA-21 持续高表达，并且是逐渐升高趋势，miRNA-21 还可能被用于预后检测，Oue等[15]研究发现对直肠癌肿瘤组织miRNA-21 进行检测，结果提示miRNA-21 高表达预示预后不良，但是CEA 水平与miRNA-21 表达水平并无明显相关性[16]；由此可见，miRNA-21 表达上调是影响直肠癌预后的重要因素，其与直肠癌细胞增殖、侵袭、淋巴结转移和临床分期密切相关。反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide，ASO)是一类2′-甲氧基修饰、能有效敲除miRNA 功能的方法，通过导入细胞相应AS-miRNA，与细胞内源miRNA分子发生特异性碱基互补配对，抑制内源miRNA 介导的RNA-induced silencing complex(RISC)活性，从而阻止miRNA 功能发挥[17]。李民等[18]通过在胶质瘤U87细胞系中，转染反义miR-21进行研究发现，AS-miR-21可以通过下调细胞内源hTERT的表达，一方面抑制胶质瘤细胞的增殖，另一方面诱导细胞的凋亡过程；王晓玫等[19]对宫颈鳞状癌细胞系CaSki的研究发现，AS-miR-21 转染可敲低CaSki 细胞中miR-21表达，并有效抑制细胞增殖活性，促进细胞凋亡。

我们在体外对HT29直肠癌细胞系进行研究发现，通过转染AS-miR-21，可以降低细胞内源miR-21的表达，从而显著抑制癌细胞的增殖活力，并且随着时间的延长，其增殖活力逐渐下降，相比于阴性对照组以及空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；细胞划痕实验结果显示，转染AS-miR-21组的癌细胞在迁移距离上，要显著低于阴性对照组和空白对照组，表明AS-miR-21的高表达能够显著抑制癌细胞的迁移能力，通过Transwell小室实验对各组细胞的侵袭能力进行评估发现，转染AS-miR-21组的癌细胞，其侵袭能力显著下降，相比于阴性对照组以及空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，表明AS-miR-21的高表达可抑制癌细胞的侵袭能力；对细胞培养液上清中的IL-6进行检测发现，细胞中AS-miR-21的高表达，能够显著降低其培养上清中IL-6的浓度，表明在直肠癌的发生发展过程中，miR-21可能通过影响IL-6的表达，参与机体的免疫应答反应。

综上所述，在直肠癌HT29细胞系中，AS-miR-21通过降低细胞内源miR-21的表达，从而削弱癌细胞的增殖活力，抑制其侵袭能力以及迁移活性，在临床治疗直肠癌中具有潜在的临床价值，为临床治疗以及预后监测提供新思路。