李 飞 周 静 孙红梅 赵 莉 张 鹏 高 峰

(延安大学附属医院心内科,延安716000)

缺氧缺血心脏疾病已经成为威胁人类生命健康的主要因素之一，其主要是由动脉狭窄、动脉阻塞等引起的，其发病机制与心肌细胞氧化损伤有关。在缺氧缺血心脏疾病发生时，心肌细胞产生大量的氧自由基，同时细胞中抗氧化酶活性降低，导致细胞膜上的脂质发生过氧化，引起细胞膜通透性的改变，引起细胞功能和结构的破坏，诱导细胞凋亡的发生[1-3]。Toll样受体4(Toll-like receptor-4，TLR4)作为一种模式识别受体，其与配体结合以后可以激活下游信号通路，调控细胞的多种生物学特性，其在淋巴细胞、上皮细胞等几乎所有细胞中都有表达，参与过敏性疾病、心血管系统等疾病的发生[4]。有研究表明，TLR4参与缺氧缺血心脏疾病的发生，在缺氧缺血心肌组织中表达异常升高[5,6]。本实验用心肌H9C2细胞作为体外研究对象，通过用H2O2处理构建心肌H9C2细胞氧化损伤模型，通过慢病毒感染沉默心肌H9C2细胞中TLR4的表达，探讨TLR4对氧化应激条件下的心肌H9C2细胞凋亡、氧化损伤及炎症因子释放水平的影响，以期为明确TLR4在缺氧缺血心脏疾病中的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1材料 绿色荧光蛋白和嘌呤霉素标记的siRNA 阴性对照慢病毒、TLR4 siRNA慢病毒由上海吉凯合成，TLR4 siRNA 序列为：CCCTCCATAGACTTCAATTAT；丙二醛(Malonaldehyde，MDA)含量测定试剂盒、IL-6含量测定试剂盒、超氧化物歧化酶 (Superoxide orgotein dismutase，SOD)活性检测试剂盒为碧云天产品；肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量测定试剂盒、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)含量测定试剂盒，活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量测定试剂盒为南京建成生物研究所产品；剪切型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)抗体、TLR4抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein，Bax)抗体购自美国Abcam。

1.2方法

1.2.1细胞分组处理 心肌H9C2细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养，培养液中含有100 U/ml的青霉素及100 μg/ml的链霉素，细胞放在37℃，5%CO2培养箱中培养。心肌H9C2细胞用含有200 μmol/L 的H2O2溶液培养12 h作为H2O2组，同时将TLR4 siRNA慢病毒感染后的心肌H9C2细胞以200 μmol/L的H2O2溶液培养12 h作为si-TLR4组，把siRNA 阴性对照慢病毒感染后的心肌H9C2细胞以200 μmol/L的H2O2溶液培养12 h作为si-NC组，把未经处理的正常培养的心肌H9C2细胞作为Control组。慢病毒感染方法如下：心肌H9C2细胞接种到6孔细胞培养板内，每个孔中加入105个细胞，细胞融合度为60%时，分别用siRNA 阴性对照慢病毒、TLR4 siRNA慢病毒以MOI=60感染细胞，24 h以后，换液，用嘌呤霉素筛选沉默TLR4的细胞株，继续培养3 d。荧光显微镜下观察细胞感染效率超过85%。

1.2.2qRT-PCR检测TLR4在H2O2处理以后的心肌H9C2细胞中的表达 取H2O2组、Control组心肌H9C2细胞，按照上述方法处理以后，用PBS将各组细胞洗涤2次。加入Trizol提取细胞中的总RNA。用DEPC水将RNA溶解以后，进行逆转录。逆转录条件为：37℃，15 min；85℃，5 s；4℃ 10 min。取各组cDNA，进行qRT-PCR，PCR程序为：95℃，15 s；60℃，60 s；共40个循环，以β-actin作为内参。引物序列如下：TLR4上游5′-ACCTGTCCCTGAACCC-TATGAA-3′，下游5′-CTTCTAAACCAGCCAGACC-TTG-3′。β-actin上游5′-ACCACAGTCCATGCCAT-CAC-3′，下游5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.2.3Western blot检测TLR4在H2O2处理以后的心肌H9C2细胞中的表达 取H2O2组、Control组心肌H9C2细胞，提取细胞中的总蛋白，保存在-80℃。蛋白样品用BCA法测定浓度。蛋白电泳：10%分离胶、5%积层胶，蛋白样品同等体积的2×Loading Buffer混匀，放置在100℃反应5 min，每个泳道中添加40 μg蛋白样品，电压为90 V，电泳约2.5～3 h，直到溴酚蓝到达底部边缘1 cm后，停止电泳。将蛋白凝胶取出以后，调整200 mA电流进行转膜，时间约为80 min。取出NC膜，用5%牛血清白蛋白置于室温条件下孵育1.5 h。再将膜置于含有1∶800 稀释的TLR4一抗、1∶1 000稀释的β-actin一抗中，置于4℃摇晃过夜。NC膜再与1∶3 000稀释的二抗在室温摇晃孵育2 h以后，ECL发光。以Quantity One软件分析各个条带灰度值，用目的条带灰度值与β-actin灰度值的比值记为目的蛋白表达水平。

1.2.4qRT-PCR和Western blot检测慢病毒感染后心肌H9C2细胞中TLR4表达 取H2O2组、si-NC组、si-TLR4组细胞，依照上述方法处理以后，用qRT-PCR和Western blot检测细胞中TLR4表达水平，检测慢病毒对H2O2处理以后心肌H9C2细胞中TLR4沉默效果。步骤同1.2.2和1.2.3。

1.2.5流式细胞术检测心肌H9C2细胞凋亡 Control组、H2O2组、si-NC组、si-TLR4组细胞按照上述方法处理以后，收集细胞，用4℃预冷的PBS将细胞洗涤2次以后，在细胞沉淀中加入400 μl的结合缓冲液重悬细胞，再加入5 μl碘化丙啶(Propidium iodide，PI)、5 μl膜联蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)，将细胞置于避光中反应20 min，再添加100 μl缓冲液，立即用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.6Western blot检测细胞中Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平 Control组、H2O2组、si-NC组、si-TLR4组细胞按照上述方法处理以后，用Western blot检测细胞中Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平，步骤同1.2.3。

1.2.7MDA、SOD、LDH、ROS水平检测 Control组、H2O2组、si-NC组、si-TLR4组细胞按照上述方法处理以后，收集培养液上清及细胞，用硫代巴比妥酸法检测细胞中MDA水平，黄嘌呤氧化法检测细胞中SOD活性，二硝基苯肼显色法检测上清中LDH含量，二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)法检测ROS水平，步骤同试剂盒说明书。

1.2.8细胞培养液中TNF-α、IL-6水平检测 Control组、H2O2组、si-NC组、si-TLR4组细胞按照上述方法处理以后，收集培养液上清，用ELISA法检测培养液上清中TNF-α、IL-6水平，步骤同试剂盒说明书。

2 结果

2.1H2O2诱导心肌H9C2细胞中TLR4表达 Control组、H2O2组细胞中TLR4 mRNA水平依次为：1.00、2.64±0.28，TLR4蛋白水平依次为：0.25±0.03、0.63±0.05。H2O2处理以后的心肌H9C2细胞中TLR4 mRNA和蛋白水平均明显升高，H2O2诱导心肌H9C2细胞中TLR4的表达和转录。见表1和图1。

2.2TLR4 siRNA慢病毒感染降低H2O2处理后的心肌H9C2细胞中TLR4的表达 H2O2组、si-NC组、si-TLR4组细胞中TLR4 mRNA水平依次为：1.00、1.00±0.12、0.10±0.06，TLR4蛋白水平依次为：0.71±0.08、0.72±0.06、0.15±0.03。心肌H9C2细胞感染TLR4 siRNA慢病毒以后，经H2O2诱导，细胞中TLR4 mRNA和蛋白水平均明显降低，说明TLR4 siRNA慢病毒感染成功下调了心肌H9C2细胞中TLR4的表达水平。见表2和图2。

2.3沉默TLR4减少H2O2诱导的心肌H9C2细胞凋亡 Control组、H2O2组、si-NC组、si-TLR4组细胞凋亡率依次为：(4.13±0.52)%、 (28.32±2.31)%、(27.96±3.45)%、(20.14±1.58)%，Cleaved Casp-ase-3蛋白水平依次为：0.15±0.02、0.36±0.03、0.35±0.06、0.23±0.04，Bax蛋白水平依次为：0.25±0.03、0.47±0.05、0.49±0.06、0.38±0.04。H2O2处理以后的心肌H9C2细胞中Bax蛋白、Cleaved Caspase-3蛋白和细胞凋亡率明显升高，H2O2诱导心肌H9C2细胞凋亡。沉默TLR4可以减少H2O2条件下心肌H9C2细胞中Bax蛋白、Cleaved Caspase-3蛋白表达，降低细胞凋亡率，提示沉默TLR4可以减少H2O2诱导的心肌H9C2细胞凋亡。见表3和图3。

表1 H2O2处理后的心肌H9C2细胞中TLR4表达变化

Note：Compared with Control，1)P<0.05.

图1 Western blot测定H2O2处理后的心肌H9C2细胞中TLR4的表达Fig.1 Western blot determination of TLR4 expression in cardiac myocytes after H2O2 treatment

表2 各组心肌H9C2细胞中TLR4表达变化

Note：Compared with H2O2，1)P<0.05.

2.4沉默TLR4抑制H2O2诱导的心肌H9C2细胞氧化损伤 Control组、H2O2组、si-NC组、si-TLR4组细胞MDA水平依次为：(10.59±1.36)、(17.82±1.23)、(17.22±1.63)、(13.54±1.05)μmol/mg，SOD水平依次为：(41.36±3.28)、(26.58±2.69)、(26.74±3.26)、(34.16±2.17)U/ml，LDH水平依次为：(85.46±8.73)、(145.37±12.98)、(145.72±10.87)、(120.86±11.64)U/L。H2O2处理以后的心肌H9C2细胞中MDA水平升高，同时细胞中SOD活性下降，细胞培养液中的LDH水平明显升高，提示H2O2可以诱导心肌H9C2细胞脂质过氧化，造成细胞氧化损伤。沉默TLR4后的心肌H9C2细胞经H2O2诱导处理以后，细胞中MDA水平降低，SOD活性升高，细胞培养液中LDH水平降低，提示沉默TLR4可以减轻H2O2诱导的心肌H9C2细胞氧化损伤。见表4。

图2 Western blot检测TLR4 siRNA对心肌H9C2细胞中TLR4蛋白表达影响Fig.2 Western blot to detect effect of TLR4 siRNA on expression of TLR4 protein in cardiac myocytes

表3 各组心肌H9C2细胞凋亡率和Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平变化

Note：Compared with Control,1)P<0.05;compared with H2O2，2)P<0.05.

2.5沉默TLR4减少H2O2诱导的心肌H9C2细胞中ROS积累 Control组、H2O2组、si-NC组、si-TLR4组ROS水平依次为：9.65±0.82、32.74±2.98、32.11±2.56、18.52±1.71。H2O2处理以后的心肌H9C2细胞ROS水平升高，提示H2O2可以诱导心肌H9C2细胞中ROS的积累。沉默TLR4后的心肌H9C2细胞经H2O2诱导处理以后，细胞中ROS水平降低，提示沉默TLR4可以减少H2O2诱导的心肌H9C2细胞中ROS的积累。见表5。

2.6沉默TLR4减少H2O2诱导心肌H9C2细胞分泌TNF-α、IL-6 Control组、H2O2组、si-NC组、si-TLR4组TNF-α水平依次为：(1.45±0.12)、(2.96±0.31)、(2.94±0.25)、(2.15±0.15)μg/L，IL-6水平依次为：(54.26±4.17)、(142.01±12.36)、(140.58±13.86)、(99.75±10.25)pg/ml。H2O2处理以后的心肌H9C2细胞培养液中TNF-α、IL-6水平升高，提示H2O2可以诱导心肌H9C2细胞分泌炎症因子。沉默TLR4后的心肌H9C2细胞经H2O2诱导处理以后，细胞培养液中TNF-α、IL-6水平降低，提示沉默TLR4可以减少H2O2诱导的心肌H9C2细胞分泌炎症因子。见表6。

图3 沉默TLR4减少 H2O2诱导的心肌H9C2细胞凋亡Fig.3 Silencing TLR4 reduces H2O2 induced cardiomyo-cyte apoptosisNote: A.Flow cytometry was used to detect the apoptosis of cardiac myocytes；B.Detection of apoptosis related protein Bax and Cleaved Caspase-3 protein in cardiac myocytes by Western blot.

表4 各组心肌H9C2细胞中MDA、SOD及培养液中LDH水平变化

Note：Compared with Control，1)P<0.05;compared with H2O2，2)P<0.05.

表5 各组心肌H9C2细胞中ROS水平变化

Note：Compared with Control，1)P<0.05;compared with H2O2，2)P<0.05.

表6 各组心肌H9C2细胞分泌TNF-α、IL-6变化

Note：Compared with Control，1)P<0.05;compared with H2O2，2)P<0.05.

3 讨论

TLR4是被第一个发现的TLR相关蛋白，参与机体的固有免疫应答，其在病原体识别、细胞程序性死亡分子结构识别等过程中具有重要作用，TLR4的分布极为广泛，在巨噬细胞、内皮细胞等中均有表达，参与肿瘤、缺血再灌注、免疫相关疾病等的发生[7-10]。很多研究表明，TLR4在缺血再灌注心肌组织中高表达，参与缺血再灌注早期和晚期炎症损伤和心肌细胞功能损伤，其可以促进心肌细胞炎症反应，阻碍心肌组织正常功能的发挥[11,12]。基因敲除TLR4后的小鼠心肌梗死的面积明显减小，TLR4基因敲除的小鼠较野生型的小鼠心功能改善程度较好，这些研究结果均提示，TLR4参与缺血缺氧心脏损伤[13,14]。

缺血缺氧心脏损伤的发病机制与氧化应激有关，缺血缺氧可以诱导心肌组织中产生大量的氧自由基，这些氧自由基过度积累导致细胞中脂质发生过氧化，引起细胞膜的通透性发生改变，使得原本存在于细胞内的LDH外漏至细胞外[15]。脂质发生过氧化的产物之一是MDA，检测MDA水平可以间接反映细胞中脂质发生过氧化的程度[16]。SOD是细胞中的氧自由基清除剂，其可以清除细胞中过量的氧自由基，维持细胞氧化平衡[17]。本次研究表明，H2O2诱导心肌H9C2细胞中MDA水平和细胞培养液中LDH水平升高，降低细胞中SOD活性，促进细胞中ROS合成，而沉默TLR4可以逆转H2O2对心肌H9C2细胞的上述作用，TLR4沉默可以减轻心肌H9C2细胞氧化损伤，提高抗氧化酶活性，TLR4可能参与心肌H9C2细胞氧化损伤过程。

心肌细胞过度凋亡与缺血缺氧心脏疾病发生有关，缺氧缺血诱导心肌细胞凋亡。研究表明，细胞内过量的ROS可以激活细胞内凋亡信号的传导，诱导细胞中Caspase-3的活化，促进心肌细胞中Bax的表达，促进细胞凋亡的发生[18,19]。缺氧缺血心脏疾病还与炎症反应有关，细胞受到氧化损伤又可以诱导细胞释放炎症因子，TNF-α、IL-6是重要的免疫调节因子，参与细胞炎症反应，在缺氧缺血心脏损伤中含量增加[20-22]。TLR4参与细胞凋亡、炎症反应等过程，在肾小管上皮细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞中均已证实[23-25]。本实验的结果显示，沉默TLR4可以减少H2O2诱导的心肌H9C2细胞凋亡，降低细胞中Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平和细胞分泌炎症因子，沉默TLR4可能通过抑制细胞凋亡和炎症减轻心肌H9C2细胞氧化损伤。

TLR4参与氧化应激条件下的心肌H9C2细胞功能发挥，沉默TLR4可以减轻心肌H9C2细胞氧化损伤，减少细胞炎症反应和细胞凋亡，本实验明确了TLR4在氧化应激条件下心肌H9C2细胞凋亡、炎症反应、氧化损伤中的作用，为以后研究缺氧缺血心肌损伤提供了坚实基础，其调控细胞凋亡、炎症等的具体作用机制还需要在以后的实验中继续探索。