谢亚锋 匡小霞 许志杰 丁雅婷 闫圣玉 张 侨 刘菀莹

(南华大学附属第二医院肛肠科，衡阳421001)

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是在全球范围内最常见的消化道肿瘤，其恶性程度高，在男性癌症发病率中居第三位，而在女性癌症发病率中居第二位。不仅如此，随着我国经济的发展，居民饮食结构以及生活方式的改变，40岁以下的结直肠癌患者越来越多[1，2]。早期结直肠癌症状不明显，容易被患者忽视，而就诊时往往伴有多器官被侵犯、有远处转移等情况发生。因此对患者而言，治疗的难度、费用以及预后等都是沉重的负担[3]。目前对结直肠癌的研究已有一定的认识，其病情的发展是多个步骤序惯性的，不只是某个特定基因突变，而是各个阶段不同基因改变的过程。现阶段对结直肠癌以手术治疗为主，但多数肿瘤被发现时已经是晚期，且在手术后容易复发，其他辅助治疗效果不明显，影响到患者的生存。所以对结直肠癌的发生机制要进一步研究，以便搜索更加有效地治疗方式。

BS69是一种新近被确认的细胞蛋白，研究发现这种蛋白既能与细胞蛋白如EMSY、c-Myb等[4]又可以与病毒蛋白[5]相互作用发挥转录抑制功能，在肿瘤的发生发展过程中起到重要作用。但迄今为止，对BS69在肿瘤方面的研究主要是在乳腺癌和恶性血液病方面，在结直肠癌方面报道很少，本研究探讨结直肠癌细胞系和患者组织中BS69蛋白和mRNA的表达情况，并分析与患者病理特征之间的关系，为结直肠癌的治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1临床资料 选择2016年8月至2017年10月间我院手术切除、术后经病理诊断为结直肠癌的组织标本60例，另取远离癌组织(离肿瘤边缘10 cm)的25例正常组织作为对照，标本提取后立即置于4%多聚甲醛中固定保存。在所有患者中，男性35例，女性25例；年龄≤65岁者44 例，>65岁者16例；局部淋巴结无转移者33例，转移者27例；肿瘤直径≤5 cm者27例，>5 cm者33例；按Dukes分期标准进行分期，其中A期 18例，B 期15例，C 期 14例，D 期13例；远处转移者13例，无远处转移者47例；直肠癌28例，结肠癌32例；临床分级：Ⅰ级 19例，Ⅱ级21例，Ⅲ级20例；所有结直肠癌病例术前均未接受放化疗或免疫治疗。

1.1.2试剂与仪器 兔抗人BS69多克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体、生物素标记的羊抗兔抗体(Thermo公司)；SV0002-12两步法免疫组化检测试剂盒、DAB 显色剂(武汉博士德生物工程有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL显色试剂盒(Thermo公司)；逆转录试剂盒、SYBR荧光定量试剂盒(TaKaRa公司)。

1.2方法

1.2.1免疫组化法检查BS69在结直肠癌组织和癌旁正常组织中的表达 采用免疫组化SP法,取手术切除的结直肠癌组织标本，经4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm 厚切片。切片常规脱蜡、水化，置于 pH6.0的枸橼酸盐缓冲液中微波加热修复，H2O2封闭，滴加适量稀释的鼠抗人 BS69多克隆抗体，抗体稀释浓度分别按1∶400，37℃ 2 h，PBS 冲洗8 min×3次，加入二抗(1∶200)，37℃孵育1 h，PBS冲洗8 min×3次，DAB 显色37℃ 20 min，苏木素复染，脱水，透明，封片，显微镜下观察。以 PBS 代替一抗作阴性对照，以已知阳性反应切片作为阳性对照。参照文献[6]对BS69阳性表达进行判定。BS69阳性染色主要定位于细胞核，细胞浆有少量存在，呈棕黄色或棕褐色颗粒;每张切片随机取5 个高倍镜视野，由两名具有多年经验的临床病理医师双盲计数，计算阳性细胞所占比例(阳性表达率)，≥10%为阳性反应，<10%为阴性反应。以0～3分对阳性表达率进行评分，当阳性表达率≤10%计0分，10%<阳性表达率≤50%计1分，50%<阳性表达率≤ 75%计2分，阳性表达率>75%计3分；染色强度为0～3分，未着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；最终的评分为两个指标的乘积。其中3分以上为高表达。

1.2.2Western blot检测 采用RIPA裂解液提取结直肠癌细胞系W480、HCT116 和 DLD1 及正常结直肠上皮细胞系 FHC的总蛋白。经BCA法蛋白定量后上样，SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白质：制备 5%浓缩胶及 12%的分离胶。电泳：调解电压至80 V、90 min后转为100 V待溴酚蓝跑至距分离胶底部0.5 cm时停止。转膜：280 mA恒流1 h，结束后关闭电源取出PVDF膜，在丽春红染液中浸泡10 min，如有条带显现说明转膜成功，采用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液封闭1.5 h。加一抗：用TBS稀释BS69(1∶200)、β-actin(1∶2 000)，4℃冰箱过夜。加二抗37℃ 2 h，结束后用TBST漂洗10 min×3次，后显影。用 Quantity One软件对蛋白质条带进行分析，测定其吸光度值。BS69蛋白的相对表达强度=BS69蛋白的吸光度值/β-actin的吸光度值。

1.2.3RT-qPCR 法检测BS69的mRNA水平 按照Trizol试剂盒说明书分别提取癌及癌旁组织的总RNA，并测定浓度，利用逆转录试剂盒进行反转录 cDNA合成，反应条件如下:预变性95℃ 5 min，95℃变性30 s，56℃退火30 s，74℃延伸 30 s，循环 40 次。实时荧光使用 ABI PRISM 7500 Sequence Detector 检测。引物由武汉擎科创新生物科技有限公司设计并合成，BS69上游引物序列:5′-AGTCTG-GCCCACGGACCAT-3′，下游引物:′-CCAGTTTGT-CTCTCCCTG-3′。以GAPDH蛋白为内参，上游引物:5′-GGATCCCTCCAGAGCGAAAAT-3′，下游引物:5′-GTCATACTTCTGCTGTTGCATGG-3′。用系统软件进行结果分析：样品的相对表达用2-ΔΔCt表示，ΔΔCt=结直肠癌ΔCt-正常结直肠黏膜组织ΔCt。

2 结果

2.1结直肠癌组织和癌旁正常组织中BS69的表达 采用免疫组化法对60例结直肠癌和25例癌旁正常组织中BS69 进行检测，结果显示BS69主要在细胞核上表达呈棕褐色、棕黄色颗粒。BS69在癌组织和正常组织中的阳性表达率分别为65%(39/60)和88%(22/25)，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。通过免疫组化图可以观察出，BS69在多数癌旁正常组织中阳性细胞数较多，颜色较深，而阳性细胞在结肠癌组织中较少，颜色较浅，详见表1、图1。

2.2结直肠癌组织中BS69的表达与临床病理学特征之间的相关性 BS69在结直肠癌组织中的表达与淋巴结转移及远处转移、肿瘤分级、Dukes 分期呈负相关(P<0.05)，而与患者的年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤部位均无明显相关性(P>0.05)。在组织分级中，BS69在Ⅰ、Ⅱ级中的阳性蛋白表达率要高于Ⅲ级中的表达(P=0.015)，无淋巴结转移者与有局部淋巴结转移者相比BS69蛋白阳性率明显上升(P=0.007)，而有远处转移者与无远处转移者相比蛋白阳性率明显降低(P=0.038)，Dukes 分期 A/B 期中的BS69阳性蛋白表达率与C/D 期相比明显上升(P=0.007)，详见表2。

表1 BS69在结直肠癌和正常组织中表达差异

图1 结直肠癌组织和癌旁正常组织中BS69的表达Fig.1 Immunohistochemical detection of BS69 expression in colorectal cancer tissues and adjacent normal tissuesNote: A.Normal colorectal tissues;B.Highly differentiated colorectal cancer tissues;C.Middle differentiated colorectal cancer tissues;D.Poorly differentiated colorectal cancer tissues.

2.3Western blot检测BS69蛋白在各细胞系中的表达 Western blot检测结果显示，BS69在FHC、DLD-1、SW480、HCT116细胞系中相对表达强度分别为 0.28±0.05、0.10±0.02、0.77±0.10、0.08±0.01，其中SW480细胞系中BS69蛋白表达最高，而 HCT116细胞系中BS69蛋白表达水平最低，且低于FHC中蛋白表达，详见图2。

2.4BS69 mRNA的表达情况 统计60例结直肠癌与25例癌旁正常组织的RT-qPCR数据，结果显示结直肠癌组织的 2-ΔΔCt均值为0.357±0.175，癌旁正常对照组织的2-ΔΔCt均值为1.000±0.224。结果相比于癌旁正常组织，癌组织中BS69的mRNA水平相对较低，差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 结直肠癌组织中BS69的表达与临床病理学特征之间的相关性

图2 Western blot检测BS69蛋白在各细胞系中的表达Fig.2 Western blot to detect the expression of BS69 protein in various cell linesNote: 1.FHC;2.DLD-1;3.SW480;4.HCT116.

3 讨论

结直肠癌是在各种肿瘤致病因素作用下，肠道黏膜上皮细胞发生基因改变导致其无法对生长进行调控，细胞周期发生紊乱、恶性增生而形成的一种消化道恶性肿瘤。文献报道[7]结直肠癌的发生率已居于癌症前三位，并可能在短时间内上升至第一，从临床医学角度看，对结直肠癌进行手术治疗以及放化疗等都可以获得有效治疗，但研究显示癌症患者死亡的主要原因是肿瘤转移，而结直肠癌最主要转移部位是肝脏，初诊时肝转移病灶仅10%～20%能够被彻底清除，绝大多数仍累及大血管，导致患者预后恢复差，中位生存期仅1年[8，9]。结直肠癌的发病机制与信号传导通路中的有关分子异常活化、表达有关，其发病是一个多基因、多步骤、多因素的复杂过程。

Hateboer等[10]首次发现的BS69 是一种腺病毒E1A 结合蛋白，这种蛋白能与E1A特异性结合，还可以抑制COS-7细胞中E1A的反式激活作用。Hateboer等[10]还用Northern杂交的方法，研究小鼠不同组织中BS69表达情况，并在所有被检测组织中发现一个转录本，结果发现在脑、肺、睾丸中表达水平较低，而在肾脏中的表达量最高。同时作为一种腺病毒结合蛋白，BS69通过289R EIA肿瘤蛋白抑制反式激活，在与各种转录因子的联系中起到协同抑制作用，对EIA的转录及反式活化起到抑制效果。但到目前为止，BS69依旧有很多生物学功能及特点仍未研究透彻。除此之外，BS69 还可能在细胞衰老过程中起到作用[11]。例如在人的原代成纤维细胞 IMR90中，使用RNA对BS69进行干扰能使其表达水平下降，原代成纤维细胞扩增速度变得非常缓慢，这说明 BS69 对细胞周期的调控有一定作用[12]；与此用时，研究者还发现 BS69作为一种转录调控的抑制因子，在各种组织细胞中广泛表达。BS69在病毒、细胞中与蛋白相互作用，发挥其转录抑制功能。同时对组蛋白H3.3K36me3甲基化修饰特异性识别，对RNA聚合酶Ⅱ的转录起到延长作用，因此BS69被认为是转录抑制因子和潜在的肿瘤抑制因子，参与了肿瘤的发生发展过程。

在本次研究中采用免疫组化法检测结直肠癌及正常组织中BS69蛋白的阳性表达率，结果分别为88%(22/25)和65%(39/60)，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)，这说明在结直肠癌组织中BS69的基因编码可能发生变异，下调其蛋白表达水平。但实验中发现少数癌组织中BS69表达呈强阳性，同时结直肠癌系细胞的Western blot检测结果发现SW480细胞系中BS69蛋白表达最高，这和少数结直肠癌组织中BS69的强阳性结果基本一致。本实验还采用RT-qPCR法检测BS69在癌组织和正常组织中的mRNA的表达水平，结果与免疫组化蛋白阳性率趋势基本一致，在结直肠癌组织中BS69 mRNA的表达水平与癌旁正常组织相比显著下降，说明BS69可能在基因的转录阶段已经出现缺失。结直肠癌细胞系Western blot检测结果显示，BS69在SW480细胞系中表达最高，而 HCT116细胞系中表达水平最低，且低于FHC中蛋白表达，这些提示BS69并不是在所有结直肠癌中低表达，这可能与不同细胞系的恶性程度有关。在BS69与临床病理学特征的相关性研究中，BS69 的表达与淋巴结转移及远处转移、肿瘤分级、Dukes 分期呈负相关(P<0.05)，而与患者的肿瘤直径、肿瘤部位、性别、年龄均无明显关系(P>0.05)，表明 BS69 低表达参与了结直肠癌的发生和发展。

综上所述，BS69 在正常组织中高表达、结直肠癌组织中低表达，因此可以被认为是一种潜在的转录抑制因子和肿瘤抑制因子，但在部分结直肠癌中出现异常高表达，说明可能在肿瘤发生发展中起到重要作用，检测癌组织中BS69表达有助于对结直肠癌恶性程度、转移和预后展开进一步研究和判断。