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下呼吸道感染(lower respiratory tract infection, LRTI)是常见感染性疾患[1],主要包括慢性支气管炎、肺炎、支气管扩张等。临床上LRTI诊断以患者出现咳嗽、咳痰、痰液粘稠，肺部出现湿罗音并伴有发热或白细胞总数和嗜中性粒细胞比例增高或X线显示肺部有炎性浸润性病变为依据；或以慢性气道疾患患者稳定期继发急性感染，并有病原学改变或X线胸片显示与入院时比较有明显改变或新病变为依据[2]。LRTI以抗生素治疗为主，但治疗前必须确定所引起下呼吸道感染的病原体，因此，LRTI病原体快速检测十分重要。标本类型及标本质量是检测的基础和根本保障，高质量的标本在快速检测中起到重要作用。病原体的检测技术迅速发展在临床LRTI的诊断和治疗起着重要支撑。目前国内少有对呼吸道病原体检测技术的综述报导。本文将下呼吸道感染标本类型和病原体检测方法进行综述，旨在指导临床根据疾病采集相应的样本类型，选择适宜的检测方法，快速确定感染病原体并及时治疗。

1 下呼吸道感染常规检测标本种类

下呼吸道感染常见标本类型有痰液、肺泡灌洗液、纤支镜防污染毛刷、外周血、浆膜腔积液。痰液是气管、支气管和肺泡所产分泌物，呼吸道病变时痰液分泌增多。收集的痰液必须是从肺部咳出且必须新鲜[3]。痰样本采集易受呼吸道正常定植菌群的影响，一般可通过定量或半定量检测或涂片检测来评价其致病性，若白细胞吞噬作用和白细胞聚集部位相应细菌的存在或定量培养分离的细菌浓度≥106cfu/mL，一般可认为是致病因子[4]。痰液中病原体最主要的检测方法是分离培养法和涂片镜检法。肺泡灌洗液可收集到肺部较大范围病原体样本，取样时应保证一定的回收量，而且避免将血液和上皮细胞带入样本[5]。分离细菌浓度≥104cfu/mL时则可认为是此病原体引起的感染。肺泡灌洗液中病原体的检测方法主要有分离培养、涂片镜检法、多重PCR等。防污染毛刷可深入肺炎病变部位定向采集样本[6]，分离细菌浓度≥103cfu/mL时则可认为是此病原体引起的感染，常用的检测方法包括分离培养、荧光定量PCR等。较严重患者的下呼吸道病原体会蔓延至外周血中，外周血样本应避免剧烈震荡，通常通过分离培养以及检测病原体的IgM抗体来确定患者被哪种病原体所感染。常用的IgM检测方法有酶联免疫吸附法、免疫荧光法、胶体金免疫层析法、荧光免疫层析法、电化学发光免疫分析等。浆膜腔积液主要包括胸水、腹水、心包积液，是严重病症的典型临床表现。常用的检测技术有分离培养、涂片镜检、荧光定量PCR法等。临床上，痰液最易采集，因而是最主要的标本类型，但是痰液采集质量不易控制，易受正常定植菌群的影响。而肺泡灌洗液和纤支镜防污染毛刷的样本类型能避免上呼吸道正常菌群的影响，样本质量更高，阳性率和合格率更高[7]。

2 下呼吸道感染常见及非常见病原体

下呼吸道感染病原体包括细菌、真菌、支原体、衣原体、病毒、寄生虫等。常见细菌类病原体主要有流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、肺炎链球菌、卡他莫拉杆菌、脑膜炎奈瑟菌、溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌等[8-9]。真菌类主要有白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔假丝酵母菌、隐球菌、组织胞浆菌、烟曲霉等[10-11]。病毒类主要有腺病毒、呼吸合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、博卡病毒、人类冠状病毒、偏肺病毒、鼻病毒、肠病毒等[12-13]。寄生虫主要有毛滴虫、肺吸虫卵、蛔虫蝴、钩虫蝴及卡氏肺囊虫等。其他类还有肺炎支原体、肺炎衣原体、沙眼衣原体等[14]。不常见的下呼吸道感染病原体主要有：人类苍白杆菌、鹦鹉热衣原体、单增李斯特菌、头孢霉菌、超鞭毛虫、蠊缨滴虫等等[15-19]。

3 病原体的检测方法

3.1 基于病原学的检测方法

3.1.1病原体分离培养法 病原体分离培养法是确定下呼吸道感染病原体的“金标准”，是临床检验科进行呼吸道分泌物检测的常规方法，也是目前我国在病原体感染状况调查研究方面的重要检测方法之一[20]。

3.1.2涂片镜检法 涂片镜检法是病原学诊断的经典方法，检测最为迅速，但特异性较差，要求实验人员有丰富的经验。临床上将分离培养法和涂片镜检法相结合，提高诊断正确性，降低假阴性、假阳性[21]。

3.2 基于分子生物学的检测方法

3.2.1聚合酶链式反应 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)是体外快速扩增特定基因或DNA序列最常用的方法，也是其他分子生物学检测方法的基础。DNA模板经高温变性后双链打开，低温复性时引物与模板结合，72 ℃下子链延伸，DNA聚合酶聚合游离的脱氧核苷酸。变性、复性、延伸三步多次循环扩增，富集目的基因。扩增反应结束后排除污染因素后结果为阳性，即确诊该病原体的感染[22]。常规PCR检测方法仅用于定性实验，在定量研究中具有一定的局限性，但它快速、灵敏、特异性强的优点与其他技术的结合对病原体的检测更为有效。

表1 下呼吸道感染检测常用标本类型 Tab.1 Specimen types detection for lower respiratory tract infection

3.2.2基质辅助激光解吸电离源联用飞行时间质谱 基质辅助激光解吸电离源(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)与飞行时间质谱(time of flight mass spectrometry，TOF MS)联用已经成为生命科学研究中非常重要的工具。用一定强度的激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场的作用下加速飞过飞行管道，由于离子飞行距离一定,不同质荷比的离子通过飞行管到达检测器的时间不同，从而达到检测目的。Atqah AbdulWahab等用MALDI-TOF MS技术对123株下呼吸道分泌物分离菌进行了鉴定，结果显示对于常见的下呼吸道病原体如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等，都有很好的鉴定性，但其对罕见的革兰氏阴性菌的鉴定可能存在一定限制[23]。Atalay A等也用此技术对下呼吸道样本和其他样本中的曲霉菌株进行了检测，其中烟曲霉、黄曲霉黑曲霉和土曲霉的检出率分别为50%、33.3%、12.5%和4.2%，与常规形态学检测有良好的一致性[24]。

3.3 基于免疫学的检测方法

3.3.1酶联免疫吸附反应 酶联免疫吸附反应(ELISA)采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，通过酶与底物产生的颜色反应进行定性和定量检测。现已有多种商业化酶联免疫吸附反应试剂盒，可检测包括流感病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体等多种常见下呼吸道病原体[25]。此方法检测快、可同时检测大量样本，对设备要求不高、操作简便，但操作规范性强，每一步操作不谨慎都有可能造成各种检测问题，假阳性较多[26]。近年来，酶联免疫吸附分析双抗夹心检测法开始应用于下呼吸道感染病原体的检测，其具有检测时间短、特异性强、灵敏度高的特点[27]。

3.3.2凝集法 凝集法是临床诊断、实验室研究和细菌学鉴定的重要手段之一。用已知细菌抗血清检测待检细菌，或用已知病原菌检测患者血清中的相应抗体。此法快速、简便、不受环境和实验条件的约束，在实验室和临床上广泛使用。

3.3.3直接免疫荧光法 直接免疫荧光法是直接用荧光标记抗体来检测特异性抗原的方法。此方法速度快、特异性强，但其敏感性不高，可能产生交叉反应而出现假阳性结果，在临床诊断方面的应用有一定局限性[22,28]。

3.3.4间接免疫荧光法 间接免疫荧光法是将样本中的特异性抗体与包被在固相上的抗原结合，已结合的抗体再与荧光标记的抗体结合，在荧光显微镜下即可观察结果。现已有多种商业化间接免疫荧光法检测多种下呼吸道感染病原体试剂盒，为病原体的检测和诊断提供了很大方便。西班牙VIRCELL公司生产的呼吸道联合检测试剂盒可检测包括嗜肺军团菌、肺炎衣原体等9种常见呼吸道病原体。莫伟平等利用此技术对13240例呼吸道感染患者血清进行检测和分析，结果显示呼吸道感染的病原体主要为肺炎衣原体和病毒，也证实了采用间接免疫荧光法检测呼吸道病原体的IgM 抗体可作为临床的诊断和治疗的重要依据[29]。

4 多病原体同时检测方法

传统方法每次仅能检测一种病原体，但大多数下呼吸道感染患者为多种病原微生物共同感染，这些病原体所引起的病症相近，仅靠常规检测难以鉴别诊断。检测多种病原微生物的技术和方法的建立不仅可以成功解决上述难题，在实验室和临床样本的筛选与分离的过程中也起着十分重要的作用。

4.1多重PCR 多重PCR是在一次PCR反应中实现对多种DNA模板检测和定量的方法。这种方法把多种病原体检测集中到一个封闭体系中反应，多反应同时进行，根据不同引物和探针对各种病原体进行定性和定量，既节约了成本又节省了时间，而且灵敏度高，大大提高病原体的检出率。实际应用中以逆转录PCR和荧光定量PCR最广泛。多重逆转录PCR常用于同时检测多种流感病毒等RNA病毒，此法具有较好的特异性和敏感性。Zhao MC等使用商业化试剂盒同时检测572份呼吸道样本中的11种常见呼吸道病毒、以及肺炎支原体和肺炎衣原体，87.5%的样本中至少有一种病原体的检出，具有高灵敏度和特异性[30]。多重荧光定量PCR的应用几乎涵盖了所有下呼吸道病原微生物的检测，N. J. Gadsby等建立了利用多重荧光定量PCR同时检测并准确定量包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等在内的8种常见下呼吸道病原微生物的方法，对249株阳性对照样本的准确定量证实了此方法的有效检测[31]。

4.2多重PCR联用毛细管凝胶电泳 毛细管凝胶电泳具有电泳和色谱的功能，能够高效分离病原体，与多重PCR的联用使得检测效率更快、灵敏度和特异性更高。Stevenson JB等用此技术建立同时检测流感病毒A、流感病毒B和呼吸合胞病毒的方法，对30个阳性样本的检出率达93%，另外两个样本因样本量过少而未能检出，此方法的建立和有效检测丰富了多病原体同时检测的方法[32]。巢式多重PCR是在普通多重PCR的基础上再进行一次或两次PCR反应，前一次的扩增反应中出现非特异性片段，则下一次的扩增中引物将不能与此片段进行匹配结合，因此它比多重PCR有更好的敏感性和特异性。蒋璐晰等利用巢式多重PCR联用毛细管凝胶电泳技术建立了同时检测13种下呼吸道病原微生物的方法，对152个临床样本的检测表现出100%的敏感性，在呼吸道病原体分子流行病学调查中具有很大潜力[33]。

4.3DNA微阵列 DNA微阵列就是将样品DNA进行PCR扩增和标记，再与含有大量不同DNA分子的DNA芯片进行杂交反应，通过检测相应位置杂交探针，实现基因信息的快速检测，具有微型化、快速、准确、灵敏度高，以及在同一芯片上同时大信息量平行检测的优势。Gemma A. Cannon等用此技术建立了同时检测16种病毒和两种非典型细菌的呼吸道病原体的方法，其在急性呼吸道病原体鉴定上对多重逆转录PCR检测具有一定替代性[34]。Keyvani H等应用DNA阵列技术检测40个呼吸道样本中的呼吸合胞病毒、副流感病毒、鼻病毒、冠状病毒和流感病毒，检出率分别为2.5%、7.5%、10%、2.5%、0%，证实此技术可同时检测多种呼吸道病毒[35]。

4.4微球体悬浮芯片技术 微球体悬浮芯片技术又称为液相芯片技术，是一种芯片技术与流式细胞术相结合的新技术。微球体悬浮芯片是微球体单元集合。微球体单元标记特异探针和特异荧光，待测样本标记另一种荧光，检测时，样本中的目标分子与探针结合。流式细胞仪通过微球体上的荧光来实现对目标分子的检测。目前已有多种商业化试剂盒。Joan-Miquel等将常用的 ResPlex II Panel v2.0 (Qiagen), MultiCode-PLx (EraGen Biosciences), and xTAG (Luminex) 3种试剂盒进行了比较，结果提示ResPlex II可检测更多病原体，MultiCode-PLx相较之下更为方便，xTAG的灵敏度较高。这些检测方法共同的不足之处是它们都是开放性平台，易于产生污染，灵敏度还有待于进一步提高[36]。Sefers SE等建立了同时检测包括呼吸道合胞病毒、人类偏肺病毒、鼻病毒等12种常见呼吸道病毒的多重PCR联用悬浮阵列方法，此方法具有快速、高通量的特点[37]。

4.5依赖核酸序列的扩增技术和重组酶聚合酶扩增技术 依赖核酸序列的扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)是一种简单快速的扩增核酸的方法，常用于扩增RNA，扩增过程中不需要热循环仪，在恒定反应温度下即可准确扩增目的RNA，1～2 h的孵育，可以使模板扩增109倍[38]。NASBA的反应过程中，靶RNA经逆转录酶催化形成RNA-DNA杂交体，在RNA酶作用下杂交体中的RNA被降解，单链DNA作为模板合成双链DNA，后者被T7RNA聚合酶不断转录出靶RNA，由此进入新一轮扩增循环，不断形成靶核酸。扩增产物需基于发光的检测器进行检测，其中，酶联寡核苷酸捕获光学检测方法(enzyme-linked oligonucleotide capture，EOC)要比电化学发光检测有着更好的灵敏度和特异性[39]。Lok Ting Lau等用NASBA-EOC方法建立了同时检测甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒等9种常见呼吸道感染病毒，检测线在10-8～10-11之间，相对于PCR检测技术来说用时更少、通量更高[40]。与NASBA相似，重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)在恒温下即可进行反应，不需要热循环仪。RPA 反应中，重组酶与上下游引物结合，与同源双链 DNA进行链交换，单链绑定蛋白与亲本链绑定，阻止其与脱离的模板链发生相互作用，然后DNA 聚合酶从上下游引物的 3′端启动模板合成，形成两条双链 DNA，如此循环重复进行扩增[41]。RPA 方法操作简单，耗时短，无需昂贵的设备及相关的专业培训，在检测的灵敏性和特异性上与荧光定量 PCR 相当。在呼吸道疾病病原体检测的应用上已有少量单种病原体的检测[42]，但鲜有同时测定多种下呼吸道病原体方法建立的报导。

4.6双光子荧光激发mariPOC○RMariPOC○R是一种用于检测呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A、B型、副流感病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型、人类偏肺病毒及肺炎链球菌病原体的抗原检测试剂盒。检测过程中，病原体在聚苯乙烯微粒上形成单克隆抗体-抗原-标记的单克隆抗体的免疫复合物，采用免疫荧光检测仪检测其荧光信号。M. Gunell等用mariPOC○R技术检测了共224 585个样品，6 897个样本检出阳性，并提出此技术可用于临床诊断[43]。郑琦等利用此技术检测人类偏肺病毒、腺病毒、肺炎链球菌等8种病原体，335例临床标本中的7种呼吸道病毒经mariPOC○R法、DFA 镜检法检测，总阳性率分别为38.21%和37.31%，一致率为98.4%，表现出比直接免疫荧光法更高的阳性率及快速、智能的特点[44]。

4.716S-Meta分析和宏基因组技术 16S-Meta分析和宏基因技术不依赖于病原体的分离和纯化，可以实现对微生物进行快速、微量、准确简便地分类鉴定和检测，在临床和实验室病原体检测中具有巨大的应用潜力[45]。16S-meta分析仅限于对细菌的检测，是将样本总DNA提取后扩增细菌16S区域，测序完成后可分析样本中病原体的组成、多样性及进化关系。测序技术运用第2代和第3代测序技术，其中第2代测序技术主要包括Illumina公司的Solexa测序技术、罗氏公司的454测序技术和ABI公司的SOLiD测序技术，以检测细菌16S区域的某个或某几个高变区来进行鉴定，具有高通量、低成本的特点。由于测序读长较短，2代测序的方法一般仅能鉴定到属水平。Kehrmann J等用Illumina平台的第2代测序技术对肺囊虫病患者和未患肺囊虫病患者肺泡灌洗液进行了检测，发现二者属水平上的微生物组成主要有葡萄球菌，肠球菌，链球菌，埃希氏菌属，沙雷菌属，乳杆菌属，韦荣球菌，奈瑟菌属和普雷沃氏菌，未能观察到两种样本之间存在显着差异[46]。随着3代测序逐渐兴起，其不需PCR富集序列，在高通量测序的基础上可以测更长的序列，有效避免样本序列信息丢失的问题。对细菌16S全长测序，更有利于对样本中微生物到种水平的鉴定，测序技术主要有Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术，Ian Toma等利用Pacific Biosciences平台对27份疑似肺炎患者的呼吸道样本进行检测，在与微生物分离培养方法比较中发现，有12个样本的检测结果有高度一致性，3个样本检测结果高度不一致，另有7个样本未能分离出病原体但在三代测序技术中有微生物检出，提示通过基于长序列测序的方法提供的诊断准确性显着提高[47]。宏基因组技术是对样本中所有微生物的全基因序列进行测序，可以更准确的鉴定到细菌、真菌、病毒等各种病原体的种水平，可进行更深层的基因注释和功能注释，在爆发流行分析和监测、院感控制和少见、新病原鉴定方面具有突出优势。楚亚男等利用对肺炎病人支气管肺泡灌洗液的全基因序列进行454焦磷酸测序，鉴定了20种呼吸道重症感染相关细菌物种，发现了两种呼吸道潜在致病菌microbacteriumlaevaniformans和borreliagarinii，检测到4种耐药基因和6种细菌侵染所需的毒力因子，为临床上快速诊断和合理用药提供了依据[48]。

表2 16S-meta分析和宏基因组技术比较及2代和3代测序比较Tab.2 Comparison of 16S-meta analysis and metagenomic technology and comparison of second and third generation sequencing

5 总结与展望

分离培养与涂片镜检法是临床治疗的重要参考，二者结合对实验室诊断更具有重要意义。虽然分离培养操作过程复杂、所耗时间长、检出限制条件多，但仍然是检验方法中的“金标准”。血清学方法也是下呼吸道病原体检测的重要方法之一，但难以避免会出现假阳性结果，影响诊断和病情。而分子生物学技术的发展日新月异，以分子生物学为基础的多种下呼吸道病原体同时检测的方法具备特异性强、敏感性高、通量高、速度快、省时、省力的优点，尤其是宏基因组技术的蓬勃发展，研究层次深和通量高的特点更是病原体检测的主流，因此分子生物学检测将成为最重要的检测方法。随着科技的发展，高度自动化的操作和多种病原体快速、高通量检测的结合，更能应对突发公共卫生事件，更能迎合个性化治疗的精准医学理念，可能成为未来下呼吸道病原体检测技术发展的趋势[49]。