叶春秀，赵曾强，田又升，王志军，于 航，庄振刚，谢宗铭

(1.新疆农垦科学院/作物种植创新与基因资源利用兵团重点实验室，新疆 石河子 832000；2.新疆农业大学，新疆 乌鲁木齐 830000)

【研究意义】新疆属于典型的灌溉农业，年降水量在200 mm以下，农业用水资源主要为雪山融水和地下水，水资源匮乏和利用水平低下成为新疆农业可持续发展的重要限制因子[1]。棉花是新疆重要的经济作物之一。生物(病虫害等)和非生物胁迫(干旱、低温等)是新疆棉花生产稳定发展的主要限制因素。当前棉花育种的主要目标是早熟、抗逆、适宜机械采收，但限于现有种质资源和传统育种手段，难以选育出适应当前生产急需的棉花品种。因此，迫切需要在种质资源和育种新技术方面有尽快突破。现代分子生物学技术的发展，特别是分子标记辅助选择技术的日益成熟，为棉花育种提供了强有力手段。国外种质资源的引进和再创新利用是解决新疆棉花种质资源遗传基础狭窄和新品种选育的重要途径。【前人研究进展】吾买尔江.库尔班[1]等对收集引进的64份国外(美国46份、前苏联5份、澳大利亚12份、墨西哥1份)陆地棉材料进行连续3年的纤维品质稳定性及衣分变化规律的初步研究，表明在新疆南疆气候条件下引进种质纤维长度、伸长率的稳定性比较好，其它纤维性状不同程度地发生变化；衣分表现为逐年增高的趋势，这些材料的收集和鉴定对新疆棉花育种工作具有重要的意义。Alisher Abdullaev[2]等详细介绍说明了乌兹别克斯坦棉花种质资源收集历史、过程及当前面临的挑战，为我国棉花种质资源工作者提供丰富的乌兹别克斯坦的棉花种质信息和收集情况。师维军等[3]对收集引进的100份国外陆地棉种质资源材料在新疆特定生态条件下的主要农艺性状、生物学性状、纤维品质、抗病性、抗虫性等方面的表现情况做了研究，筛选出一批具有一定利用价值的材料，促进新疆棉花种质资源及育种工作的开展。【本研究切入点】面对新疆棉花生产进一步发展的需要，从种质资源研究角度来说，一方面加强种质资源材料的收集引进工作，尤其是国外材料的收集引进具有重要意义，另一方面对引进种质在新疆地区适应性、抗逆性等方面进行鉴定对种质资源的评价和利用具有深远意义。【拟解决的关键问题】本文通过对乌兹别克斯坦引进的种质资源进行抗旱性评价，并筛选相关的分子标记，为开展棉花多抗、宜机采种质资源创新和新品种选育奠定技术和基因资源基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验以从乌方引进棉花种质资源7份种质资源为研究材料，材料名称分别为：引2、引4、引20、引23、引22(红茎)、引22、引2(抗旱)。

1.2 试验方法

实验材料为水培培养，于材料长出6片真叶时采用PEG进行处理，分别采集处理0，2，4，6，8 d的叶片，锡箔纸包装，液氮速冻保存，每份材料取样3份用于后期生理生化指标测定。测定的生理生化指标包括SOD(超氧化物歧化酶)、POD(过氧化物酶)、CAT(过氧化氢酶)活性分析、MDA(丙二醛)含量、超氧阴离子含量、可溶性蛋白含量、APX(抗坏血酸过氧化物酶)等。其中SOD测定采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法测定[4]；POD采用愈创木酚法测定[5]；CAT活性参照田又升等[6-7]方法；MDA含量采用硫代巴比妥酸法[4]、超氧阴离子含量测定参照Elstner等[8]方法；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法测定[9]。

1.3 抗旱分子标记筛选

通过查阅相关文献，初步合成了8对抗旱性SSR标记，具体序列如表1。

由上海生工生物技术有限公司合成。PCR反应体系为20 μl，包含10×Buffer(含Mg2+)2.0 μl，dNTP 0.4 μl，引物2 μl，TaqDNA聚合酶0.2 μl (5 U/L)，模板DNA 2 μl，其余用ddH2O补充至20 μl。扩增程序为95 ℃预变性3 min，94 ℃变性50 s，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR反应在PCR仪中进行。扩增产物先在40 g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，相机拍照、保存和计数1.4 数据分析。

实验数据采用Excel 2013进行整理和作图。

2 结果与分析

2.1 引进种质干旱处理POD、CAT活性变化趋势

由图1可以看出，所有种质在干旱处理后，POD活性都呈上升趋势，但种质引4、引2(抗旱)、引22在干旱处理整个过程POD活性显著高于其它4个种质，根据相关参考文献初步推断种质引4、引2(抗旱)、引22较其它种质耐旱。所有种质在干旱处理后，CAT活性变化趋势存在差异，其中种质引4、引20、引23在整个干旱处理过程CAT活性变化呈先上升，后下降的波动趋势；种质引22、引22(红茎)、引2、引2(抗旱)CAT活性变化从处理2 d后几乎都呈下降趋势，根据相关参考文献初步推断种质引4、引20、引23较其它种质耐旱。

表1 引进种质抗旱性分子标记筛选引物序列

图1 引进种质干旱处理POD、CAT活性变化趋势Fig.1 The trend of POD and SOD activities

图2 引进种质干旱处理MDA、超氧阴离子含量变化趋势Fig.2 The trend of MDA and superoxide content

2.2 引进种质干旱处理MDA、超氧阴离子含量变化趋势

由图2可以看出，所有种质在干旱处理后，MDA含量变化趋势在整个干旱处理过程中几乎一致(先上升后下降)，不存在显著的差异性。所有种质在干旱处理后，超氧阴离子含量变化趋势存在差异，其中种质引4、引20、引22、引23超氧阴离子含量变化呈持续上升趋势，直至处理8 d所有种质含量无明显差异；而种质引22(红茎)、引2、引2(抗旱)超氧阴离子含量变化在整个过程中呈持续下降的趋势，根据相关参考文献初步推断，种质引4、引20、引22、引23较其它3份种质耐旱。

2.3 引进种质干旱处理可溶性蛋白含量、APX(抗坏血酸过氧化物酶)变化趋势

由图3可以看出，所有种质在干旱处理后，可溶性蛋白含量变化趋势存在差异，其中种质引2、引4、引20、引23可溶性蛋白含量变化呈持续上升趋势，直至处理8 d所有种质含量无明显差异；而种质引22(红茎)、引22、引2(抗旱)可溶性蛋白含量在整个过程中呈持续下降趋势，根据相关参考文献初步推断，种质引2、引4、引20、引23较其它3份种质耐旱。

所有种质在干旱处理后，APX活性变化趋势差异不明显，其中只有种质引23的APX活性在处理2 d时急剧上升，为其它种质APX活性的4倍，而其它种质在干旱处理的整个过程APX活性变化趋势几乎一致，初步说明APX活性不能很好地作为鉴定引进种质抗旱性的指标。

图3 引进种质干旱处理可溶性蛋白含量、APX(抗坏血酸过氧化物酶)变化趋势图Fig.3 The trend of APX and protein content

图4 引进种质抗旱性相关标记筛选Fig.4 Molecular marker related to drought

2.4 引进材料的抗旱性相关分子标记筛选

通过筛选最终有2对引物在引进种质之间有差异条带，将标记筛选结果与生理生化指标鉴定结果进行对比，发现引物B扩增结果与其具有一致性，其中耐旱种质引4、引20、引23、引22红能够得到与其它3份种质不同的扩增条带(图4)，多出1条扩增条带，初步分析该引物可能是与耐旱性相关的标记。

3 讨 论

棉花种质资源的收集、研究和利用收到世界各产棉国的高度重视，丰富的种质资源和遗传多样性是培育优良品种的必要条件，通过引进各类丰富的种质资源是拓展种质遗传基础的有效方法，同时对引进材料进行农艺性状、抗逆性等方面的鉴定，可以为棉花育种提供丰富、有用的亲本材料，加快育种进程[11-14]。张香桂等[15]为了有效利用引进的的棉花种质资源，对引进国外的154份种质材料进行主要农艺和经济性状研究，发现引进的材料类型较为丰富，具有选用矮杆、高籽指、高强纤维材料的潜力，同时具有较强的改良产量因素的潜力。刘少卿等[16]通过对引进的200份棉花种质耐热性进行鉴定，筛选出了高温耐热性种质，用于育种和基础研究中。朱竹青等[17]对来自中国、美国、法国等国家的114份棉花种质资源进行了生育、产量性状、纤维品质及抗黄萎病、棉铃虫性鉴定，结果表明这些资源具有较强的生育性状选择潜力，筛选出一批具有不同优异性状的种质材料，为棉花育种中有目的利用材料提供了参考。赵丽芬等[18]对引进巴基斯坦的54份棉花种质材料进行田间鉴定，结果表明引进的种质类型丰富，在抗高温、抗病、改良纤维品质和提高产量等方面具有较高利用价值。

4 结 论

本研究通过对引进种质抗旱性相关指标的测定，推断在引进的几份种质中，种质引4、引20、引23耐旱性较强，种质引22稍弱，其它种质属于干旱敏感型材料，能够将结果用于实际育种过程中，同时抗旱相关分子标记的筛选能够为分子标记辅助育种提供鉴定方法和应用。