何 迪，韩 笑，贺敬婷，陈立志，马 烨，翟俊峰，刘 畅*

(1.锦州医科大学 药学院，辽宁 锦州 121000;2.中国科学院 长春应用化学研究所，吉林 长春 130000)

近年来，临床上抗生素的广泛应用以及局部存在的不合理、不规范用药现象，使得细菌耐药性问题日趋严峻，引起了全世界的普遍关注。耐药菌，尤其是多重耐药菌的产生和传播，给人和动物感染性疾病的治疗带来了极大困难[1-2]。因此，临床和常规的细菌耐药性测试对耐药菌株的监测和控制有着极其重要的意义。长期以来，抗生素的药敏实验作为细菌耐药性检测的重要方法和手段被广泛应用，不仅为临床上细菌感染性疾病的治疗提供有力支持，并且为新药开发和科学研究提供了基础数据支撑。传统的药敏实验如肉汤稀释法和纸片扩散法[3-4]，虽然可以获知病原微生物的敏感抗生素，但存在耗时长、操作复杂以及难以提供药物浓度和受试微生物被抑制率的准确关系等缺陷。因此，开发一种安全快速、方便实用的药敏测试方法来监测和检测抗菌药物有效性及细菌耐药性具有重要意义。

中性红(NR)作为一种碱性吩嗪染料，常被用于酸碱指示剂；又因其可以通过电引发-电聚合法制备聚中性红(PNR)材料而被广泛应用于电极表面修饰。研究表明：在较高的电位区间内经电引发，可以使中性红产生阳离子自由基，该阳离子自由基与中性红单体或另一个阳离子自由基反应生成中性红低聚合物；在较低电位下，该低聚物即可氧化成相应的阳离子自由基，并进一步与中性红单体或另一个阳离子自由基反应生成分子量更大的中性红聚合物(PNR)[5-6]。PNR既保留了单体中性红良好的氧化还原性，又通过修饰电极的方式避免了试剂浪费以及环境污染问题[7]。目前PNR修饰电极的应用主要集中在对过氧化氢[8]、葡萄糖[9]、谷氨酸[5]、多巴胺[10]、DNA[11]等方面的测定。此外，因中性红结构中具有氧化还原中心，在生物电化学实验中可代替氧作为微生物呼吸作用所产生电子的最终接受体。本研究首次将PNR修饰玻碳电极(PNR/GCE)与抗菌药物有效性的检测联系起来，以埃希氏大肠杆菌(E.coli)为受试菌株，将该生物电化学体系分别引入头孢哌酮、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星4种常用抗菌药物的有效性测试。实验表明，最优条件下制备的PNR/GCE稳定性好，可反复多次用于同体系的电化学测试，对基于呼吸作用的生物活性的变化响应灵敏，且可以精确测得不同浓度抗菌药物对受试微生物的抑制率。本方法所得药敏实验结果与传统的纸片扩散法所得结果相一致，但操作更简单，周期更短，因此可作为传统药敏实验的补充方法，进一步应用于临床细菌的耐药性测试和抗菌药物的有效性检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI832C电化学分析仪(上海辰华仪器公司)；三电极体系：裸玻碳电极(GCE)或PNR/GCE为工作电极，Ag/AgCl(3 mol/L KCl)为参比电极，铂丝电极为对电极；KYC-100B空气恒温摇床(上海福玛实验设备有限公司)；721可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司)；SYQ-DSX-280B型压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械有限公司)；SW-CJ-1E洁净工作台100级(上海博迅实业有限公司)；数控超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)。

1.2 修饰电极的制备

用0.05 μm的Al2O3粉在抛光布上将GCE表面抛光至镜面，用水冲洗后依次用硝酸(体积比1 ∶ 1)、无水乙醇、水超声清洗电极，每次3 min，晾干。将晾干后的GCE转入0.5 mol/L H2SO4溶液中，于-0.5～1.6 V电位下进行循环扫描至循环伏安图稳定为止，取出后用水淋洗干净，晾干备用。将处理后的GCE置于PBS+0.5 mol/L NaNO3+ 5.0×10-4mol/L NR体系，于-1.4～1.8 V电位下，以100 mV/s的扫描速率引发15圈，再于-0.8～0.8 V电位下聚合15圈，取出后用水淋洗干净，即制成PNR/GCE，于PBS中保存。

1.3 E.coli的培养及处理

将LB培养基和PBS 于1.0×105Pa灭菌20 min，移至超净台，冷却至室温，待用。在无菌条件下，取20 μL已解冻的E.coli菌种接种至20 mL LB培养基中，于37 ℃、120 r/min摇床中恒温活化6 h。随后，移取200 μL此活化菌液接种至330 mL LB培养基中，于相同条件下培养过夜。培养后的菌液经4 000 r/min离心10 min，弃去上层培养基，菌体沉淀以PBS洗涤3次后，悬浮于适量PBS溶剂中。采用721可见分光光度计于600 nm处检测菌悬液的光密度值(OD600)，并将其调节为0.5，以此菌悬液进行抗生素有效性检测实验。

1.4 抗菌药物的有效性测定

平行配制7份溶液，成分均为45 mL预制备的菌悬液和5 mL新鲜配制的GGA(终浓度为220 mg/L)，并将其密封于电解池，在37 ℃、120 r/min的摇床中恒温培养20 min。取1份上述菌悬液设为空白对照(无抗菌成分)，其余6份加入不同量的抗菌药物，再移至37 ℃、120 r/min摇床中继续恒温培养40 min。因抗菌药物的抑制作用，与空白对照中的菌体相比较，其余样品中菌体的呼吸作用将有所减弱，产生的电子数量也相应减少。

图1 基于PNR/GCE测定抗菌药物有效性的原理Fig.1 Schematic diagram for the detection of antibacterial efficacy based on PNR/GCE

中性红作为一种良好的电子媒介体，可通过细胞膜上酶的转移作用接受微生物呼吸作用产生的电子，并还原为5,10-二氢中性红。结合电化学分析仪，在-300 mV电压下通过检测5,10-二氢中性红的氧化电流强度，即可衡量微生物在呼吸作用中产生的电子数量，并将其量化为活性，如图1所示。抗菌药物有效性可采用对比健康菌体和与抗菌药物作用的菌体的活性差值获得，本文以抑制率表示，公式为：Efficacy%=(Inor-Ianti)/Inor×100%，式中，Inor为氧化正常微生物呼吸作用产物的极限电流值；Ianti为氧化受抗菌药物影响的微生物呼吸作用产物的极限电流值；Efficacy%为抗菌药物有效性。

图2 NR浓度对制备PNR/GCE的影响Fig.2 Effect of NR concentration on PNR/GCE preparation

图3 pH值对NR电聚合的影响Fig.3 Effect of pH value on NR electropolymerization

2 结果与讨论

2.1 电极修饰条件的优化

2.1.1NR浓度的影响分别在浓度为0.05、0.1、0.5、1.0 mmol/L的NR溶液中进行电聚合，通过比较CV图中峰电流大小考察了NR浓度对制备PNR/GCE的影响。如图2所示，随着NR浓度的增大，峰电流逐渐增大，当NR浓度增至0.5 mmol/L时，峰电流达到最大，表明此时的聚合效果最好，实验结果与文献[5]一致。继续增加NR浓度至1.0 mmol/L，则峰电流无明显变化。因此，选择NR的最佳浓度为0.5 mmol/L。

2.1.2扫描段数的影响考察了扫描段数对NR聚合效果的影响。在聚合过程中，分别设定扫描段数为10、20、30和40。实验结果显示，初始阶段随着扫描段数的增加，PNR/GCE的峰电流值显著增大，当扫描段数为30时，峰电流值达到最大，继续增加扫描段数，峰电流值有所下降，且峰形变差。因此，实验选择NR在GCE表面电聚合的最佳扫描段数为Segment 30。

2.1.3缓冲溶液pH值的影响考察了缓冲体系pH值对聚合效果的影响，分别在pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的PBS缓冲溶液中制备PNR/GCE。如图3所示，在pH值5.5～7.0范围时，随着溶液pH值的增大，PNR/GCE峰电流不断增大，表明在此范围内随着pH值的增大其聚合效果越来越好。但继续增大溶液至pH 7.5时，峰电流值突然下降至低于pH 5.5时的峰电流值，表明NR在GCE表面的电聚合效果变差，且在聚合过程中，肉眼可观察到部分NR沉淀。实验结果表明，NR在偏酸性溶液中的聚合效果较中性环境差；在偏碱性溶液中，NR的溶解度小，更加不利于NR的电聚合。因此，后续实验选择中性环境pH 7.0作为NR在GCE表面的电聚合条件。

2.1.4支持电解质NaNO3浓度的影响分别在浓度为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mol/L的NaNO3溶液中进行NR的电聚合反应，结果表明，当NaNO3浓度为0.1～0.5 mol/L时，随着NaNO3浓度的增加，峰电流值增大，聚合效果更好；但继续增大NaNO3浓度至0.7 mol/L时，峰电流值有所下降；当NaNO3浓度增至0.9 mol/L时，峰电流值显著下降，且肉眼可观察到聚合完成后，修饰液中出现NR沉积。推测高浓度电解质导致NR电聚合效果变差的原因可能是由于其降低了NR分子的表面电位，使修饰液出现絮凝[12]。据此，后续实验选择0.5 mol/L NaNO3作为支持电解质的最佳浓度。

2.2 修饰电极的重现性与稳定性

取同一支PNR/GCE在PBS缓冲液中平行扫描10次CV图，所得峰电流的相对标准偏差(RSD)仅为1.5%，表明该修饰电极的重现性良好。将上述修饰电极用水清洗后，置于4 ℃条件下于0.2 mol/L PBS(pH 7.0)中保存14 d，再在PBS缓冲液中扫CV图，峰电流为新制备PNR/GCE的97.3%，表明该修饰电极具有良好的稳定性。

图4 E.coli浓度对药敏实验灵敏度的影响(左氧氟沙星浓度为5～30 mg/L)Fig.4 Effect of E.coli concentration on sensitivity of drug sensitivity experiment(Clevofloxacin=5-30 mg/L)

图5 反应时间对药敏实验灵敏度的影响(左氧氟沙星浓度为5～30 mg/L)Fig.5 Effect of reaction time on sensitivity of drug sensitivity experiment(Clevofloxacin=5-30 mg/L)

2.3 药敏实验的条件优化

2.3.1E.coliATCC25922使用浓度对药敏实验的影响本实验选择E.coli敏感且具有代表性的喹诺酮类抗菌药左氧氟沙星用于筛选E.coli的最佳使用浓度，其浓度(OD600)梯度值分别为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0，左氧氟沙星浓度分别为5、10、15、20、25、30 mg/L。结果表明，经1 h培养后，伴随OD600值的下降，左氧氟沙星的有效性增强；当OD600值为0.5时，左氧氟沙星的有效性达到最大，其抑制率为38.6%～64.0%；继续降低OD600值，左氧氟沙星的有效性不再增强，甚至有所降低(图4)。即OD600值为0.5时，E.coli对左氧氟沙星最为敏感。

2.3.2反应时间对药敏实验的影响当受试微生物E.coli的浓度为0.5(OD600)时，以左氧氟沙星作为模型药物，考察了不同反应时间对药敏实验灵敏度的影响。结果表明，当反应时间为10～40 min时，随着反应时间的延长，药物对E.coli生物活性的抑制作用不断增强；然而，随着反应时间在60～80 min内增加，药物对E.coli呼吸抑制作用逐渐减弱(图5)，其原因可能是在长时间反应中，微生物代谢过程中的细胞色素P450酶生化反应使抗菌药物发生了降解[13-14]。在保证药敏实验灵敏度的前提下，为减少测试时间并提高测试效率，后续实验均选择40 min作为最佳反应时间。

图6 GGA浓度对药敏实验灵敏度的影响(左氧氟沙星浓度为5～30 mg/L)Fig.6 Effect of GGA concentration on sensitivity of drug sensitivity experiment(Clevofloxacin=5-30 mg/L)

2.3.3GGA溶液的影响文献表明，营养物质会对受试微生物的活性产生一定影响，进而影响体系的灵敏度[15]。但针对不同的体系，营养物质的作用结果未必相同。因此，本研究在上述优化条件下，即菌浓度OD600=0.5，培养时间为40 min，左氧氟沙星浓度为5～30 mg/L时，考察了GGA对药物有效性的影响。结果显示，GGA溶液的终浓度为220 mg/L(BOD5)时，5 mg/L左氧氟沙星对E.coli的有效性为38.6%；而当体系中无GGA存在时，30 mg/L左氧氟沙星对E.coli的有效性仅为29.1%，体系灵敏度下降(图6)，其原因可能是细菌在饥饿时期对抗菌药物的耐药性增强[16]。可见，在本体系中，营养物质GGA是提高电化学药敏实验灵敏度的关键因素之一。

2.4 抗菌药物的有效性检测

采用上述优化实验条件，以NR作为媒介体的电化学方法测定抗菌药物有效性，将头孢哌酮、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星和万古霉素与E.coli(OD600=0.5)共同培养40 min。其中前4种抗菌药物对E.coli具有强烈的抑菌效果，半数抑菌浓度(通常指能引起受试生物的某种效应50%抑制的浓度，此处指E.coli产生的电流值降低50%的浓度)分别为34.15、27.98、8.83、11.49 mg/L。由于万古霉素只对革兰氏阳性菌起作用，故其浓度高达80 mg/L时对E.coli的抑制率也仅为23.3%。

表1 头孢哌酮、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星及万古霉素对E.coli的纸片扩散法结果Table 1 Results of cefoperazone,amikacin,gentamycin, levofloxacin and vancomycin on E.coli by disk diffusion method

2.5 与纸片扩散法的比较

纸片扩散法作为传统药敏实验方法常被用于检验电化学药敏测试方法的可靠性，采用的药物浓度以电化学药敏测试方法得到的各种抗菌药物的半数抑菌浓度为基础，结果如表1所示。电化学药敏实验中所对应的半数抑菌浓度在纸片扩散法中产生相应的中度敏感的结果，头孢哌酮、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星的抑菌圈直径分别为10.2、10.9、11.5、13.9 mm；而针对革兰氏阳性菌的万古霉素，采用电化学药敏试验得到最大抑菌效果时的80 mg/L在纸片扩散法中仍为耐药结果。显然，电化学药敏测试方法得到的结果与经典的纸片扩散法具有良好的一致性。

3 结 论

本文通过对NR浓度、扫描段数、缓冲体系pH和支持电解质NaNO3浓度等影响因素的优化，成功制备了稳定性好、重复性好、灵敏度高的PNR/GCE。以该修饰电极为工作电极，利用一定外加电压下获得的NR的极限电流值确定受试微生物E.coli的细胞活性，进而确定抗菌药物对E.coli的抑制效果，据此建立了测定抗菌药物有效性的电化学分析方法。结果表明，该PNR/GCE不仅可以用于抗菌药物有效性的检测，且相较于传统的药敏实验，此方法更为快速简便，可精确测得抗菌药物的有效率，有望作为检测抗菌药物有效性传统方法的补充用于临床检测和新药研发等领域。