陈雪蕾，李冬梅，徐厚君，王学生，王曼曼*

(1.华北理工大学 公共卫生学院，河北 唐山 063210；2.华北理工大学 药学院，河北 唐山 063210)

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是一类分子结构中含有两个或两个以上苯环的碳氢化合物，是典型的持久性有机污染物[1]。PAHs种类多、分布广，具有“三致”毒性，已被国际癌症研究机构(IARC)确认为第一组致癌物质[2-3]。PAHs广泛分布于污染的空气、水体、土壤、食物和烟草烟雾等介质中，相对于一般环境，PAHs暴露接触浓度和暴露剂量在职业环境中尤为突出[4-5]。PAHs可经呼吸道、消化道和皮肤等多种途径进入机体，对人体健康造成有害影响，有研究表明PAHs暴露与肺癌、膀胱癌和女性乳腺癌等多种癌症的发生有关[3,6-7]，因此获得准确PAHs暴露水平是进行PAHs健康评价以及安全控制的前提。

进入人体内的PAHs经肝脏代谢并转化为结合态的羟基多环芳烃(Hydroxyl polycyclic aromatic hydrocarbons，OH-PAHs)，随后经尿液或粪便排出体外[8]。考虑到PAHs暴露途径多样化，同时尿液样品无创、易得，尿液中的OH-PAHs被广泛用作生物标志物以综合全面评价PAHs在人体暴露水平[9]。芘的代谢物1-羟基芘是最常用的PAHs职业接触生物标志物，Shen等[10]将焦炉工人尿液中1-羟基芘作为PAHs内暴露标志物，评估了机体长期暴露于PAHs对炎症反应和肺功能的影响；Bal等[11]通过尿液中1-羟基芘含量来评估沥青道路铺设工人暴露于PAHs对DNA氧化损伤的影响。但越来越多的研究显示，联合尿液中多种OH-PAHs能够更全面评估人体暴露于PAHs的水平[12-14]。因此，建立简单、快速测定尿液中多种OH-PAHs的方法对于PAHs暴露健康评价具有重要意义。

尿液中OH-PAHs的分析测定包括样品前处理以及仪器分析两个环节，其中仪器分析包括液相色谱-荧光法(HPLC-FLD)、气相色谱-质谱法(GC-MS)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[15-18]。由于尿液中待测物含量低，不易检出，且尿液成分复杂，干扰测定，因此尿液样品前处理成为仪器分析之前重要且关键的步骤。目前，测定尿液中OH-PAHs常用的前处理方法主要包括液液萃取法(Liquid-liquid extraction，LLE)[19]和固相萃取法(Solid-phase extraction，SPE)[12,20-21]。

固相支撑液液萃取法(Solid supported liquid-liquid extraction，SLE)是在传统液液萃取法的基础上，采用硅藻土作为吸附剂，利用其结构多孔、吸水性强、性质稳定等特点，从而在互不相溶的两相实现快速微观液液萃取的一种新型前处理方法[22-23]。与LLE相比，多孔的硅藻土表面能够形成一层薄薄的液膜，提供了大的比表面积，从而提高了萃取效率；而与SPE相比，SLE避免了活化和淋洗步骤，操作简化，且具有不易产生乳化现象的优点。目前，SLE已成功应用于食品、生物和环境等领域的样品前处理。Seo等[24]采用SLE结合气相色谱-串联质谱法，建立了同时测定苹果果汁、玉米等食品中7种N-亚硝胺的分析方法；Gao等[25]利用SLE结合超高效液相色谱-质谱法测定了血液中的双甲脒及其代谢物；Wang等[26]建立了基于SLE结合气相色谱法测定淡水鱼及水体中共平面多氯联苯的方法。

本研究将固相支撑液液萃取法用于尿液中OH-PAHs的前处理，并结合超高效液相色谱-串联质谱法，建立了简单、快速同时测定尿液中7种OH-PAHs的分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LCMS-8060超高效液相色谱-串联质谱仪(日本岛津公司)；DKZ-2型电热恒温振荡水槽(上海精宏实验设备公司)；ET-3001氮吹浓缩仪(北京欧陆科仪进口仪器有限公司)；KQ-700GVDV型双频恒温数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；ISOLUTE®SLE+(1 mL)固相支撑液液萃取柱(北京绿绵科技有限公司)。

1-羟基萘(1-Hydroxy-naphthalene,1-OHNap)、2-羟基萘(2-Hydroxy-naphthalene,2-OHNap)、2-羟基芴(2-Hydroxy-fluorene,2-OHFlu)和9-羟基芴(9-Hydroxy-fluorene,9-OHFlu)(纯度≥98.0%，北京Dikma科技有限公司)；2-羟基菲(2-Hydroxy-phenanthrene,2-OHPhe)、9-羟基菲(9-Hydroxy-phenanthrene,9-OHPhe)、2-羟基萘-D7(2-Hydroxy-naphthalene-D7,2-OHNap-D7)、2-羟基芴-D9(2-Hydroxy-fluorene-D9,2-OHFlu-D9)、1-羟基菲-D9(1-Hydroxy-phenanthrene-D9,1-OHPhe-D9)、1-羟基芘(1-Hydroxy-pyrene,1-OHPyr)、1-羟基芘-D9(1-Hydroxy-pyrene-D9,1-OHPyr-D9)(≥98.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司)；β-葡萄糖醛酸酶-芳基硫酸酯酶水溶液(Type HP-2，≥100 000 unites/mL，美国Sigma-Aldrich公司)。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯(色谱纯，美国Fisher公司)；甲基叔丁基醚、正己烷(色谱纯，北京迪科马科技有限公司)；石油醚、乙酸(分析纯，上海阿拉丁试剂公司)；无水乙酸钠(≥99%，天津市大茂化学试剂厂)。

1.2 标准溶液的配制

OH-PAHs标准储备液：用甲醇配制浓度为1.0 g·L-1的上述7种OH-PAHs(2-OHNap、1-OHNap、9-OHFlu、2-OHFlu、2-OHPhe、9-OHPhe、1-OHPyr)以及4种同位素内标物(2-OHNap-D7、2-OHFlu-D9、1-OHPhe-D9、1-OHPyr-D9)的标准储备液，于4 ℃避光保存。使用时，分别准确量取上述标准储备溶液，使用甲醇稀释成浓度为10.0 mg·L-1的标准工作液。

1.3 样品的采集与制备

采集连续工作5天的河北省某企业无吸烟史的石油工人晨尿，于-80 ℃存储。使用时，将尿液样品自然解冻至室温，混合均匀，准确量取5 mL于15 mL具塞离心管中，加入10 μLβ-葡萄糖醛酸酶-芳基硫酸酯酶混合水解酶液和20 μL混合内标溶液后，再加入5 mL 0.5 mol·L-1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 5.0)。将以上混合液置于恒温振荡水槽中，37 ℃避光水解4 h后，于1 500 r·min-1离心10 min，取上清液于4 ℃储存待用。另采集在校大学生晨尿，处理方法同上，作为非职业暴露人群对照样品。

本实验经华北理工大学医学伦理委员会批准。

1.4 SLE流程

准确量取0.8 mL尿液样品酶解液上样至SLE萃取小柱，静置5 min，使样品完全吸附在支撑材料表面，随后加入6 mL乙酸乙酯进行洗脱，收集洗脱液并氮吹至干后，用甲醇定容至200 μL并经0.22 μm微孔滤膜过滤。整个萃取过程需10 min。

1.5 UPLC-MS/MS分析条件

色谱柱为XR-ODS柱(100 mm×2.0 mm I.D.，2.2 μm，日本岛津公司)，流动相为乙腈和水，采用梯度程序洗脱，20 min内乙腈的比例从5%线性增长至100%。流速为0.3 mL·min-1，进样量10 μL，柱温26 ℃。

采用电喷雾电离(ESI)源，多反应监测模式(MRM)采集，负离子(-)模式检测，雾化气流量为3 L·min-1，干燥气流量10 L·min-1，加热气流量10 L·min-1，接口温度300 ℃，脱溶剂温度300 ℃，加热块温度400 ℃，碰撞诱导解离气体230 kPa。7种OH-PAHs以及4种同位素内标物的保留时间、母离子、子离子等参数见表1。

表1 7种OH-PAHs及4种同位素内标物的质谱参数Table 1 MS parameters of seven OH-PAHs and four isotope internal standards

2 结果与讨论

2.1 固相支撑液液萃取条件的建立

OH-PAHs是一类极性化合物，常使用C18作为吸附剂的固相萃取法进行样品前处理。固相支撑液液萃取能够用于水相体系中极性化合物的有效前处理，不同于传统的固相萃取法，固相支撑液液萃取过程仅有上样和洗脱两个步骤，其中洗脱步骤是影响方法准确度的关键因素，因此实验考察了洗脱溶剂种类和体积对目标物回收率的影响。

图1 洗脱溶剂种类对7种OH-PAHs回收率的影响(n=3)Fig.1 Effect of eluting solvent type on recoveries of seven OH-PAHs(n=3)

图2 氮吹浓缩压力对7种OH-PAHs回收率的影响Fig.2 Effect of nitrogen evaporation pressure on recoveries of seven OH-PAHs

在对照尿液基质样品中加入7种OH-PAHs混合标准溶液，加标水平均为5 mg·L-1，固定上样体积为0.8 mL，洗脱体积为6 mL，分别以甲基叔丁基醚、石油醚、正己烷和乙酸乙酯4种有机溶剂作为洗脱溶剂对目标物进行洗脱(n=3)，结果如图1所示。乙酸乙酯对目标物的洗脱效果最佳，7种OH-PAHs的回收率均能达到90%以上，特别是对苯环数为2的2-OHNap和1-OHNap，平均回收率为96.6%～103%，说明SLE对所选目标物具有良好的萃取能力。为了节约溶剂，同时避免由于洗脱溶剂过多而引起的误差，实验对洗脱溶剂体积分别为5、6、7 mL时进行考察(n=3)。结果表明，当乙酸乙酯的体积由5 mL增至6 mL时，7种OH-PAHs的回收率增加；进一步增加洗脱体积，回收率降低，这是由于洗脱溶剂体积的增加延长了氮吹浓缩时间，造成了目标物损失。因此实验最终选择6 mL乙酸乙酯进行洗脱。对尿液样品的整个SLE前处理过程仅需10 min，操作简单、快速、省时。

2.2 氮吹浓缩条件的建立

氮吹浓缩是样品前处理过程中必不可少的环节，也是影响目标物回收率的重要参数。实验中，2-OHNap和1-OHNap易挥发，因此固定氮吹温度为25 ℃，对氮吹浓缩压力在20～55 kPa范围内进行了考察。上样体积为0.8 mL，使用6 mL乙酸乙酯进行洗脱，对7种OH-PAHs加标浓度均为5 mg·L-1的尿液样品平行测定3次，由图2可知，随着氮吹压力的升高，目标物的回收率也随之增高，当氮吹压力达到34 kPa，继续增大氮吹压力时，各化合物的回收率变化不大。然而，当氮吹压力达到55 kPa时，回收率降低。因此实验最终选择最佳氮吹压力为48 kPa。

2.3 方法验证

2.3.1线性范围、检出限与定量下限在最优实验条件下，配制一系列含7种不同浓度的OH-PAHs标准溶液按照实验方法进行测定，每个浓度标准溶液中均含3mg·L-1的同位素内标溶液。采用同位素内标法定量分析，以目标物定量离子峰面积和内标物色谱峰面积的比值(y)对相应的目标物质量浓度(x，mg·L-1)进行线性分析，实验结果见表2。7种OH-PAHs在0.3～3 000 mg·L-1范围内线性关系良好，相关系数r≥0.995 1。

使用对照尿液样品溶液逐级稀释标准溶液，以定量离子信噪比S/N=3和S/N=10计算方法的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)，得到7种OH-PAHs的LOD为0.05～1.0 mg·L-1，LOQ为0.15～3.0 mg·L-1(见表2)。

2.3.2回收率与相对标准偏差在对照尿液样品中添加3个水平的7种OH-PAHs标准溶液进行加标回收实验，日内(n=3)和日间(n=3)平行测定，计算平均回收率及相对标准偏差(RSD)。如表2所示，7种OH-PAHs在3个加标水平下的平均回收率为70.8%～117%，日内和日间RSD分别为3.7%～9.6%和3.7%～11%。方法具有良好的精密度和准确度。

表2 7种OH-PAHs的线性关系、检出限、定量下限及回收率Table 2 Linear relationships,LODs,LOQs and recoveries of seven OH-PAHs

2.4 实际样品的分析

在最优实验条件下，将方法应用于10例石油工人尿液样品与10例对照人群尿液样品中7种OH-PAHs的测定，结果如表3所示。按OH-PAHs种类进行分类，两组人群体内的7种OH-PAHs均有检出，使用IBM SPSS 19.0软件进行统计学分析，对7种OH-PAHs 的浓度值进行正态分布检验，结果均呈非正态分布，因此人群尿液中7种OH-PAHs的含量采用中位数和四分位数间距表示；石油工人与对照人群的差异性分析采用Mann-Whitney U检验(检验水准α=0.05)，除2-OHPhe和9-OHPhe外，石油工人尿液中5种OH-PAHs的浓度均高于对照人群浓度，差异具有统计学意义(p<0.05)。图3为对照尿液样品及加标样品经SLE处理后的7种OH-PAHs的MRM图。

表3 石油工人和对照人群尿液样品中7种OH-PAHs的分析结果(n=10)Table 3 Seven OH-PAHs concentrations in human urine samples from petroleum workers and control group(n=10)

* no detected;** no value

2.5 与文献方法的对比

将本方法对尿液样品中OH-PAHs的测定结果与常用的前处理方法(如LLE、SPE)进行比较(表4)。结果显示，本方法的准确度和灵敏度良好，回收率与文献相当。此外，相比于LLE的试剂消耗量大，SPE的操作步骤繁琐，SLE仅需上样和洗脱两步共10 min即可完成前处理工作，方法操作简单快速，且消耗有机溶剂少，基质效应低。

表4 本研究与文献报道方法的对比Table 4 Comparison of the developed method with the reported methods for determination of OH-PAHs in urine samples

3 结 论

本研究建立了基于SLE结合UPLC-MS/MS同时测定职业暴露工人尿液中7种OH-PAHs的分析方法。实验对SLE过程中的洗脱步骤进行了优化，并考察了氮吹浓缩条件的影响。在最优条件下，7种OH-PAHs在0.3～3 000 mg·L-1范围内线性关系良好，检出限为0.05～1.0 mg·L-1，定量下限为0.15～3.0 mg·L-1，加标回收率为70.8%～117%。该方法简单、快速，为尿液中多环芳烃代谢物测定提供了新思路，对环境中多环芳烃分析以及对人体健康评价具有重要意义。