王 敏，孟 爽，谷梦巧，迟宽能，马玉婵，邓 燕，李德蕾，张 茜，胡 蓉，杨云慧

(云南师范大学 化学化工学院，云南 昆明 650500)

卟啉化合物是一类大环共轭芳香骨架化合物，其母体化合物称为卟吩，有取代基的卟吩则称为卟啉。卟啉环是一个高度共轭的系统，有26个π电子，故外观呈黑色。许多卟啉以与金属离子配合的形式存在于自然界中，如含有二氢卟吩与镁配位结构的叶绿素以及与铁配位的血红素[1]。这些物质都参与了动植物的重要生命活动。同时，该类化合物良好的光、热稳定性以及优越的物理性质、化学性质和其它性能，使得卟啉化学得到了很好的发展。卟啉化合物的光电性能使之可用于光电传感器的研制。

C-反应蛋白(C-Reactive protein，CRP)是外界对系统的刺激在肝脏中产生的一种急性期蛋白质[2]，是人类不同炎症过程和组织损伤的众所周知的诊断生物标志物[3-4]，甚至是心脏病发作、心律不齐以及猝发中风的前兆[5]物质。CRP是一个可靠的用于判断组织破坏、细胞坏死和炎症的参考指标，其生物学半衰期不会因为机体的年龄、肝脏或肾脏功能、药物治疗而受到影响。新的标准化CRP分析为慢性炎症疾病的纵向检测提供了可能性，并且可帮助诊断并发症[6]。传统的CRP检测方法有乳胶凝集实验[7]、放射免疫法[8]、酶联吸附法[9]等，但这些方法存在需使用大型仪器、价格昂贵、样品用量大等缺点，因此，发展灵敏、准确、快速、节省样品的CRP的检测方法在临床上具有重要意义[10-11]。

从电化学方法演变而来的光电化学是一门蓬勃发展的学科，自贝克勒尔1839年发现光电效应以来[12-14]，光电化学已经成为研究热点。光电化学过程是指分子、离子或半导体材料等因吸收光子而使电子受激发产生电荷传递，从而实现光能向电能转化的过程。具有光电化学活性的物质受光激发后发生电荷分离或电荷传递过程，从而形成光电压或者光电流[15]。光电化学传感器是利用具有光电活性的物质来检测待测物的传感装置[16]。在光电化学传感中，光作为激发源，光电流被记录为检测信号。光电化学过程的激发信号和检测信号完全分离，使得传感系统具有高的灵敏度和低的背景信号，特别适用于低浓度生物分子的测定[17]。此外，光电化学传感系统还具有电化学传感器方便、低成本、快速且易于使用的固有特性，已被广泛应用于生物传感和生物分析[18]。

近年来，贵金属纳米颗粒材料因生物相容性良好、易于合成、化学稳定性好、比表面积大等特点[19-20]以及优异的电导率和表面等离子体共振效应[21-22]，在增强光电化学传感器的光电流响应方面得到了有效应用。本文采用低成本方法合成卟啉多孔化合物(PAF)，并利用掺杂金纳米颗粒的卟啉多孔化合物研制了一种以金纳米颗粒为催化剂的无标记型光电免疫传感器用于CRP的快速检测，通过检测光电响应值实现了对C-反应蛋白(CRP)的无标记型定量测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

PEAC 200A型光电化学反应仪、ITO玻璃片(天津艾达恒晟科技发展有限公司)；CHI660D型电化学工作站(上海辰华仪器公司)；TGL-20M离心机(湖南长沙湘仪离心机有限公司)。

间-四苯基卟吩(C44H30N4，97%)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)购于上海麦克林生化科技有限公司；三氯甲烷(CHCl3)和盐酸(HCl)购于重庆川东化工有限公司；六水合氯化铝(AlCl3·6H2O)、无水乙醇(C2H5OH)、甲醇(CH3OH)、30%过氧化氢(H2O2)、磷酸缓冲溶液(PBS,pH 7.4)、壳聚糖、牛血清蛋白(BSA)均购于美国Sigma公司；氯金酸(HAuCl4)购于昆明铂锐金属材料有限公司;C-反应蛋白抗体(anti-CRP)、C-反应蛋白抗原(CRP)购于上海领潮生物科技有限公司；丙酮(C3H6O)购于云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司。

1.2 PAF的合成

参考文献合成PAF[1]。称取间-四苯基卟吩(385 mg,0.62 mmol)和AlCl3(3.00 g,4.5 mmol)置于100 mL两颈圆底烧瓶中，在氮气保护下向圆底烧瓶中加入40 mL干燥的三氯甲烷，60 ℃油浴下反应48 h。反应结束后，搅拌冷却至室温，离心收集粗产物。将得到的粗产物分别用无水乙醇、3 mol/L的HCl和甲醇洗涤3次，之后将产物在120 ℃真空中干燥，得到黑色粉末，即为PAF。

1.3 金纳米颗粒的合成

参照文献[23]合成金纳米颗粒。在100 mL洁净、干燥的三颈圆底烧瓶中加入50 mL去离子水和1%500 μL的氯金酸，混合均匀，在搅拌下加热至沸腾后(180 ℃)，加入1.75 mL 1%柠檬酸三钠，继续加热15 min，直至溶液变成酒红色的金溶胶，即得金纳米颗粒的分散溶液。

1.4 Au NPs@PAF的合成

称取50 mg PAF固体颗粒分散到25 mL去离子水中，超声数分钟使其分散均匀，再取15 mL “1.3”中合成的纳米金溶胶加入到该混合溶液中，搅拌24 h使金纳米颗粒被PAF充分吸附，离心后用去离子水洗涤3次，真空干燥后得到Au NPs@PAF。

1.5 光电免疫传感器的制备

将ITO玻璃片分别用丙酮、高温灭菌水和无水乙醇超声5 min，自然晾干。将2 mg/mL Au NPs@PAF与壳聚糖(CHIT)等体积混合均匀后，取10 μL滴在处理好的ITO玻璃片上，然后滴加10 μL 50 μg/mL的C-反应蛋白抗体，于37 ℃恒温培育1 h，随后滴加10 μL 1%BSA以封闭非特异性结合位点，培育1 h，用灭菌水冲洗未吸附的BSA，晾干后滴加10 μL不同浓度的C-反应蛋白，培育1 h后晾干。最后在常温下，于电解池中分别加入4 mL PBS缓冲溶液和10 μL过氧化氢(100 mmol/L)，并将晾干的ITO玻璃片固定在电解池中，以0.7 V的电压测量光电响应电流值。

2 结果与讨论

2.1 检测原理及方法

图1 光电免疫传感器的制备流程Fig.1 Preparation procedure of the photoeletrochemical immunosensors

图2 Au NPs@PAF的透射电镜图Fig.2 TEM image of Au NPs@PAF

卟啉多孔化合物PAF具有良好的光电响应，与金属纳米颗粒混合后其光电响应值增强，同时该混合物可作为固定基质固定C-反应蛋白抗体，本文通过在其上滴加CRP进行培育。由于形成的免疫复合物可阻碍电子传递，导致光电流响应减小，电流减小的程度与CRP的浓度成反比，从而制得无标记型光电免疫传感器。本实验以PBS作为缓冲溶液，100 mmol/L(10 μL)过氧化氢作为电子供体，实现了对CRP的光电检测。原理如图1所示。

2.2 材料的表征

2.2.1PAF的合成实验发现，合成产物在750 cm-1附近出现一个因对位取代苯环而产生的峰，与文献[1]一致；其透射电镜图和X射线粉末衍射(XRD)图也与文献[1]基本吻合，表明本实验成功合成了PAF。

2.2.2AuNPs@PAF的微观形貌取适量的Au NPs@PAF制样后置于透射电子显微镜下观察，结果(图2)显示，Au NPs已成功负载在透明薄片状的PAF上，且颗粒分布均匀。

2.3 不同材料修饰的ITO玻璃片的光电化学响应

实验考察了不同材料修饰的ITO玻璃片的光电化学响应，结果如图3所示。裸ITO玻璃片的光电响应电流很小(曲线a)；卟啉单体修饰的ITO玻璃片的光电流响应在裸ITO玻璃片的基础上略有增加(曲线b)；PAF修饰的ITO玻璃片的光电响应电流比卟啉单体修饰的又有所增加(曲线c)，说明PAF的光电响应比卟啉单体大；Au NPs@PAF修饰的ITO玻璃片的电流响应(曲线d)相对曲线c明显增加，这是因为金纳米颗粒催化PAF，使其有较强的光电响应。

2.4 不同修饰电极界面的交流阻抗行为

图4 不同修饰电极界面的交流阻抗行为Fig.4 Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) by using different modified electrodesa.bare GCE;b.PAF/CHIT/GCE;c.Au NPs@PAF/CHIT/GCE; d.anti-CRP/Au NPs@PAF/CHIT/GCE;e.BSA/anti-CRP/Au NPs@PAF/CHIT/GCE;f.CRP/BSA/anti-CRP/Au NPs@PAF/CHIT/GCE;0.1-10 000 Hz

图5 不同修饰的ITO玻璃片在含有100 mmol/L过氧化氢 的PBS缓冲溶液中的I～t响应曲线Fig.5 I-t response curve of different modified ITOs in phosphate buffer solution containing 100mmol/L H2O2a.bare ITO;b.PAF/CHIT/ITO;c.Au NPs@PAF/CHIT/ITO; d.anti-CRP/Au NPs@PAF/CHIT/ITO;e.BSA/anti-CRP/Au NPs@PAF/CHIT/ITO;f.CRP/BSA/anti-CRP/Au NPs@PAF/CHIT/ITO

实验利用玻碳电极，通过交流阻抗表征了传感器界面的层层修饰过程，图4是玻碳电极层层修饰过程中各界面在含有5 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6及0.1 mol/L KCl溶液中的交流阻抗谱。裸电极的阻抗曲线近似一条直线(曲线a)，说明裸玻碳电极对电子传递几乎没有阻碍;PAF/CHIT修饰的玻碳电极的阻抗值比裸的ITO玻璃片略微增大(Ret=250 Ω，曲线b)，说明PAF/CHIT对电子传递有一定的阻力；Au NPs@PAF/CHIT 修饰的玻碳电极的阻抗值比曲线b略大(Ret=750 Ω，曲线c)，说明金纳米颗粒成功修饰在PAF上;anti-CRP/Au NPs@PAF/CHIT修饰的玻碳电极的阻抗值比曲线c明显增大(Ret=1 100 Ω，曲线d)，说明anti-CRP阻碍了[Fe(CN)]64-/3-传递电子，表明anti-CRP已经固定在玻碳电极上；BSA/anti-CRP/Au NPs@PAF/CHIT修饰的玻碳电极的阻抗值比曲线d增大(Ret=1 750 Ω，曲线e)，说明BSA充分封闭了非特异性结合位点;CRP/BSA/anti-CRP/Au NPs@PAF/CHIT修饰的玻碳电极的阻抗值在曲线e的基础上进一步增大(Ret=2 500 Ω，曲线f)，表明CRP与anti-CRP特异性结合成功，形成不导电的免疫复合物，从而使阻抗增大。

2.5 不同修饰ITO玻璃片的光电化学特性

采用计时电流法表征ITO玻璃片的层层修饰过程，结果如图5所示。裸ITO的光电响应曲线对光响应很小(曲线a)。由于PAF自身具有较强的光电响应，使得PAF/CHIT修饰的ITO玻璃片对光的响应电流值明显增大(曲线b);由于金纳米颗粒对PAF的催化作用，使Au NPs@PAF/CHIT修饰的ITO玻璃片的电流在曲线b的基础上明显增大(曲线c)，表明金纳米颗粒与PAF成功结合并对电流有协同增强作用；由于抗体对电子传递有阻碍作用,anti-CRP修饰Au NPs@PAF/CHIT的ITO玻璃片的电流值相较于曲线c明显减小(曲线d)，说明anti-CRP与Au NPs@PAF结合成功;经BSA封闭后，anti-CRP修饰的Au NPs@PAF/CHIT/ITO玻璃片的光电流响应值有略微减小，证明BSA充分封闭了非特异性结合位点(曲线e)；结合了CRP抗原后的BSA/anti-CRP/Au NPs@PAF-CHIT/ITO玻璃片的电流响应明显减小，说明CRP抗原与anti-CRP进行了充分结合。综合上述过程，本实验原理得到验证。

2.6 实验条件优化

2.6.1PAF质量浓度对光电响应电流值的影响实验考察了不同质量浓度的PAF对光电响应电流的影响。结果显示，PAF从0.5 mg/mL增至2 mg/mL时，电流响应值随之增大，并在2 mg/mL时达到最大，当继续增加PAF质量浓度时，响应电流随PAF质量浓度的增大而减小。因此，选择2 mg/mL作为PAF的最佳质量浓度。

2.6.2过氧化氢浓度对光电响应电流值的影响H2O2作为供电子基，在检测体系中起传递电子的作用，从而影响电流值。本实验选取不同浓度(1、5、20、50、100、300、500 mmol/L)过氧化氢作为供电子基测量免疫传感器的响应电流值。结果显示，电流值随H2O2浓度的增大逐渐增大，当H2O2浓度达100 mmol/L时，电流值达到最大，随后趋于平缓，因此选择100 mmol/L作为测量基底中H2O2的浓度。

2.6.3测量电势对光电响应电流值的影响电势的大小直接影响电信号的大小，本实验对光电免疫传感器的测量电势进行了优化。结果显示，当测量电势从100 mV升至700 mV时，CRP的电流响应值与空白电流响应值的比值逐渐增大，当测量电势继续升至1 200 mV时，两者的比值逐渐减小。因此选择700 mV作为该光电免疫传感器的的最佳测量电势。

2.6.4CRP抗体培育时间对光电响应电流值的影响温度的高低直接影响抗原与抗体结合的稳定程度。为了考察CRP抗体培育时间对响应电流的影响，本实验在不同时间(15、30、40、60、75、90 min)下培育CRP抗体。结果表明，响应电流值随抗体培育时间的增加而减小，并于60 min时达到最低值，此后电流值随培育时间延长而逐渐趋于稳定，由于本免疫传感器为信号减小型，所以选择60 min 作为抗体的培育时间。

2.6.5CRP抗体质量浓度对光电响应电流值的影响实验考察了不同CRP抗体质量浓度(0.5、5、10、30、50、80、100 μg/mL)对响应电流的影响。结果表明，随着CRP抗体质量浓度的增加，电流值逐渐减小，当抗体质量浓度为50 μg/mL时电流值最低，此后继续增加CRP抗体质量浓度，传感器的响应电流值逐渐趋于稳定，故本实验选择50 μg/mL作为该光电免疫传感器的最佳CRP抗体质量浓度。

2.6.6CRP培育时间对光电响应电流值的影响为了让CRP抗体与CRP抗原达到稳定的结合状态，从而得到最佳的响应电流，对CRP抗原培育时间进行了优化。固定50 μg/mL抗体和50 ng/mL抗原，改变抗原培育时间。结果表明，当培育时间在10～60 min 时，电流值随培育时间的延长而减小，60 min时电流达到最佳，此后电流响应值逐渐趋于稳定，所以选择60 min作为该光电免疫传感器的最佳CRP培育时间。

图6 CRP光电化学免疫传感器的选择性Fig.6 Selective of the CRP photoelectrochemical immunosensorA:photoelectric response current of CRP comparing with that of different interfering substances,B:photoelectric response current of CRP mixed with different interference substances

2.7 传感器的校准曲线

在最优实验条件下，培育不同浓度的CRP，检测光电免疫传感器的响应电流值。结果显示，CRP的质量浓度(C)在0.05 ～60 ng/mL范围内与响应电流(I)呈较好的线性关系，线性方程为I=-1.987C+169.81，相关系数r2=0.994 6。以3SD/k计算出检出限为0.017 ng/mL。

2.8 光电免疫传感器的选择性

实验选择500 ng/mL人绒毛促性腺激素(HCG)、前列腺特异抗原(PSA)和1%的牛血清蛋白(BSA)为干扰物质，与空白溶液和50 ng/mL CRP溶液的响应电流进行对比。结果如图6A所示，干扰物的响应电流与空白溶液的响应电流相差不大，但50 ng/mL CRP溶液的响应电流相比空白溶液有明显变化，说明HCG、PSA和BSA基本不造成干扰，此光电免疫传感器对CRP有较好的选择性。

将1 000 ng/mL丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、葡萄糖(G)作为干扰物质，分别与50 ng/mL的CRP等体积混合，并与50 ng/mL CRP溶液的电流响应进行对比。结果如图6B所示，混合溶液的响应电流与CRP溶液相差不大，说明Ala、Glu、Gly和G对此光电免疫传感器的干扰很小。

2.9 光电免疫传感器的回收率测定

采用标准加入法，在稀释过的血清样品中加入低、中、高3种不同质量浓度的CRP进行回收率测定。每个质量浓度平行测定3次。结果如表1所示，其平均回收率为102%，相对标准偏差(RSD)为1.7%～3.0%，结果令人满意，说明该传感器可用于血清中CRP的检测。

表1 真实血样中CRP回收率的测定Table 1 Recovery of CRP in real human serum

2.10 与其它CRP检测方法的对比

对比CRP的其它检测方法 (表2)，本文所制的传感器具有较低的检出限。并且由于该传感器无需标记，故其制备简单，使用方便省时。

表2 几种CRP检测方法的对比Table 2 Comparison of several detection methods of CRP

3 结 论

本实验以间-四苯基卟吩合成了具有优良光电响应特性的卟啉多孔化合物PAF，并将其与金纳米颗粒掺杂在一起的混合物作为固定基质将C-反应蛋白抗体固定在ITO玻璃片上，在此基础上滴加C-反应蛋白进行培育，形成免疫复合物。该免疫复合物可阻碍电子传递，导致光电流响应减小，电流减小的程度与CRP的浓度成反比，从而制得无标记型的CRP光电传感器。该传感器制备简单，使用方便省时。