李志, 冉茂乾， 焦彦朝

(1.六盘水市山地特色生态产品研究中心，贵州 六盘水553000；2.贵阳海关出入境检验检疫综合技术中心国家果蔬检测重点实验室(六盘水)，贵州 六盘水553000；3.贵阳海关出入境检验检疫综合技术中心，贵州 贵阳 550081)

刺梨(RosaroxbunghiiTratt)又名九头鸟、文先果，是一种稀有的果实，在我国主要分布于贵州、四川、湖北和云南等地[1-5]，果实富含维生素、糖、有机酸、胡萝卜素，尤其是维生素C含量极高，被称为“维C之王”[6-9]；其花、叶、果和籽均可入药，有健胃、消食、滋补及止泻的功效[10]，具有很高的药用价值.单宁属于鞣酸类物质，广泛分布于植物界[11-12]，具有收敛、防晒、美白、保湿及防腐等功效[13]，目前对其他来源提取单宁有很多文献报道，如刘宁等[14]关于微波法提取香蕉皮中水解单宁的工艺研究，章莉娟等[15]关于核桃青皮中单宁的微波辅助提取工艺，薛文艳等[16]关于麻栎橡子单宁脱除工艺优化及抗氧化性，但鲜见刺梨中单宁的提取研究报道[17-21].本文运用Box-Behnken中心组合试验和响应面法[22-25]对刺梨单宁提取工艺进行优化，以刺梨单宁得率为指标，考察乙醇浓度、超声时间、料液比、超声功率对刺梨单宁提取得率的影响，从而找出最优提取工艺参数，为刺梨单宁的提取建立一种可靠、稳定、便捷的方法，为单宁的开发利用提供一定的理论基础.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

刺梨：市售；丙酮(分析纯)、氨水(分析纯)、无水碳酸钠(分析纯)、醋酸锌(分析纯)、氯化铵(分析纯)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)(分析纯)：均为国药集团化学试剂有限公司；单宁标准品：北京坛墨质检科技有限公司、Folin-Denis试剂：国药集团化学试剂有限公司.

1.2 仪器与设备

UV-2600/2700岛津紫外可见分光光度计：日本岛津公司；AS20500BDT超声波清洗器：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；HG200 均质机：普利赛斯国际贸易(上海)有限公司；HWS恒温水浴锅：上海慧泰仪器制造有限公司；FA1004B电子分析天平：上海佑科仪器仪表有限公司；DH-2000R高速台式冷冻离心机：上海德洋意邦仪器有限公司；GenPure Pro 超纯水仪：赛默飞世尔科技实验室产品；JXFSTPRP-24全自动样品快速研磨仪：上海净信实业发展有限公司；电热恒温鼓风干燥箱：北京兰贝石恒温技术有限公司；ExcelTM电动移液器：广州菲罗门科学仪器有限公司.

1.3 实验方法

1.3.1 单宁标准曲线的绘制

准确称取0.1 g(精确至0.001 g)单宁标准品于100 mL容量瓶中，并用超纯水定容至刻度，得到1 000 mg/L标准储备液，放入4 ℃冰箱中备用；分别移取0、10、20、30、40、50 μL单宁标准储备液至10 mL容量瓶中，分别加入5.0 mL超纯水、1.0 mL Folin-Denis试剂及3.0 mL质量分数为20%的Na2CO3溶液，并用超纯水定容至刻度，在沸水中加热2 min，混匀，即得单宁浓度分别为0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L的标准液，显色，放置2 h，以标准曲线0.0 mg/L为空白，在765 nm波长下测定标准溶液的吸光度，绘制标准曲线，即为：y=1.256x+0.587 5，R2=0.999 85.

1.3.2 样品的测定

称取刺梨果实匀浆2 g(精确至0.001 g)于250 mL锥形瓶中，用70%的乙醇按料液比1∶10 (g/mL)加入20 mL的提取溶剂，放入超声提取仪中提取10 min，超声仪提取条件为功率100 W、温度60 ℃、超声频率80 Hz，提取液加压抽滤，即得待测样品溶液；吸取1 mL待测样品溶液，按1.3.1节标准曲线的绘制方法测定其在765 nm波长下的吸光值.

1.3.3 测定吸光度，计算刺梨单宁的得率[13]

式中：ω—刺梨单宁得率；β—提取液中单宁浓度,单位为mg·mL-1；10—提取液定容体积,单位为mL；A—提取液稀释倍数；m—刺梨取样质量,单位为g.

1.4 单因素实验

1.4.1 乙醇浓度对刺梨单宁提取得率的影响

准确称取2 g刺梨果实匀浆3份，每份按料液比1∶10(g/mL)加入20 mL乙醇溶液，提取条件为：功率100 W、浸提10 min，分别考察不同乙醇浓度(70%、75%、80%、85%、90%)对刺梨单宁得率的影响，试验重复3次浸提.

1.4.2 浸提时间对刺梨单宁提取得率的影响

准确称取2 g刺梨果实匀浆3份，每份按料液比1∶10(g/mL)加入20 mL乙醇溶液，提取条件为：功率100 W、乙醇浓度85%，分别考察不同浸提时间(10、20、30、40、50 min)对刺梨单宁得率的影响，试验重复3次浸提.

1.4.3 料液比对刺梨单宁提取得率的影响

准确称取2 g刺梨果实匀浆3份，每份加入85%的乙醇溶液，提取条件为：功率100 W、浸提40 min，分别考察不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)对刺梨单宁得率的影响，试验重复3次浸提.

1.4.4 超声功率对刺梨单宁提取得率的影响

准确称取2 g刺梨果实匀浆3份，每份加入85%乙醇溶液，提取条件为：浸提40 min、料液比为1∶20(g/mL)，分别考察不同提取功率(100、150、200、250、300 W)对刺梨单宁得率的影响，试验重复3次浸提.

1.5 响应面试验设计

根据Box-Behnken试验原理[24-25]，选取乙醇浓度、浸提时间、料液比和超声功率四个因素为自变量，以单因素试验结果为参考依据，以刺梨单宁得率为响应值，采用四因素三水平的响应面优化这些因素，每个试验组重复3次，取其平均值.试验因素水平及编码见表1.

表1 响应面分析因素水平及编码

2 结果与分析

2.1 各因素的试验结果

2.1.1 乙醇浓度对单宁得率的影响

图1 乙醇浓度对单宁提取得率的影响

由图1可知，当乙醇浓度为85%时，刺梨单宁提取得率最大；乙醇浓度低于85%时，随着乙醇浓度的增加，刺梨得率随之增大；乙醇浓度高于85%时，刺梨单宁提取得率反而有所下降.其原因可能是随着乙醇浓度的提高，细胞中蛋白质发生变性，阻碍了单宁的溶出，故提取得率下降.因此选择85%的乙醇作为提取溶剂.

2.1.2 浸提时间对单宁得率的影响

图2 浸提时间对单宁提取得率的影响

由图2可知，当浸提时间在10～40 min时，刺梨单宁的提取得率随着时间的延长而逐渐提高；浸提时间为40 min时，刺梨单宁得率最大；浸提时间大于40 min，因为超声波是一种机械波，长时间的作用于刺梨样品会引起单宁结构的破坏，同时又造成其他杂质溶出，从而影响刺梨中单宁提取得率，故刺梨单宁提取得率下降；因此提取时间选择40 min为宜.

2.1.3 料液比对单宁得率的影响

图3 料液比对单宁提取得率的影响

由图3可知，随着料液比的提升，刺梨单宁提取得率逐渐增大，其原因是随着提取溶剂的增加会提高传质推动力，促进刺梨单宁的浸出；当料液比达到1∶20(g/mL)之后，刺梨单宁得率增速放缓，细胞中单宁基本溶出，溶剂中单宁含量趋于饱和，增速不明显，为节约提取成本及提取时间，选择1∶20 (g/mL)的料液比为宜.

2.1.4 超声功率对单宁得率的影响

图4 超声功率对单宁得率的影响

由图4可知，当超声波提取功率在100～250 W时，随着提取功率的增加刺梨单宁得率逐渐增大，其原因是提取功率较小时，超声波不足以使刺梨细胞壁破裂，故提取单宁得率偏低，随着超声波功率的增加，超声波产生的机械效应越强，促使刺梨样品细胞组织破裂变形，有助于单宁溶出，故单宁得率逐渐增加；当提取功率为250 W时，刺梨单宁提取得率最大；当提取功率大于250 W时，刺梨单宁得率反而降低，其原因是其他水溶性杂质的浸出会影响刺梨中单宁的提取得率，故功率选择250 W为宜.

2.2 响应面法优化刺梨单宁提取工艺参数

2.2.1 Box-Behnken试验及结果

以单因素试验结果为依据，根据Box-Behnken试验原理[26]，选用表1中的四因素三水平为响应面优化因素，应用Design Expert 8.05软件对表2中数据进行回归拟合分析，得到单宁含量与乙醇浓度(A)、超声时间(B)、料液比(C)、超声功率(D)等各因素的二次回归方程：单宁得率=44.14+0.53A+0.16B+0.12C+0.27D+0.19AB-0.30AC-0.38AD+0.86BC-0.30BD+0.018CD-1.77A2-1.13B2-0.55C2-1.05D2.

2.2.2 回归方差分析

由方差分析表3可知，模型的F=9.88，P<0.000 1表明该模型极显著，失拟项P=0.917 8>0.05，说明失拟项对于纯误差不显著；相关系数R2=0.908 1和调整系数 RAdj2=0.816 2，可知拟合情况良好，能真实反映各影响因子与响应值之间的关系，能较好地对响应值进行分析与预测.乙醇浓度和超声时间交互项、乙醇浓度和超声功率交互项、乙醇浓度二次项、超声时间二次项、超声功率二次项极显著；乙醇浓度一次项、料液比二次项显著；其余因素的交互作用、二次项、一次项对刺梨单宁提取得率影响不显著.根据F值的大小可知各因素对刺梨单宁提取得率影响的主次关系是乙醇浓度(A)>超声功率(D)>超声时间(B)>料液比(C).

表2中心组合试验方案及结果

Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding extraction yields

试验号因素ABCD刺梨单宁得率/%1-10-1040.94210-1042.533-101041.774101042.1750-10-140.946010-141.8870-10141.948010142.239-100-140.0910100-141.9511-100141.5412100141.871300-1042.08140-11042.34150-1-1042.7816011042.8817-110040.43181-10041.5619-1-10040.8420110041.912101-1-141.9822001-142.472300-1142.9324001142.7425000044.1926000044.527000044.5128000044.4729000044.03

表3 方差分析表

*P<0.05，表示差异显著；**P<0.01，表示差异极显著

2.2.3 响应面分析

乙醇浓度、超声时间、料液比、超声功率中的两个因素固定为零水平，就可以组合得到另外两个因素的交互作用(见图5)，在响应面图中曲面越陡峭，则表明两因素的交互作用越显著；反之，则说明因素变化对响应值影响较小；由图5可知，AB与AD响应曲面坡度最陡，说明乙醇浓度与超声时间、乙醇浓度与超声功率之间的交互作用对刺梨单宁得率影响显著；其余因素的交互作用对刺梨单宁得率影响不显著.

2.2.4 优化与验证试验

应用Design Expert 8.05软件求解二次回归方程，可以得到刺梨单宁提取工艺的最优参数：乙醇浓度85.35%、超声时间40.15 min、料液比1∶20.35(g/mL)、超声功率250.56 W，软件分析得到最大响应值(单宁得率)为45.86%.考虑到单宁提取实际工作中操作的可行性将工艺参数修正为：乙醇浓度85%、超声时间40 min、料液比1∶20(g/mL)、超声功率250 W.为了验证结果的可靠性，采用修正参数做3次平行试验，其实验结果单宁得率为44.98%，与预测值45.86%基本吻合.因此，应用Design Expert 8.05软件得到的单宁提取工艺参数真实可靠，具有实际应用价值.

图5 因素交互作用对刺梨单宁提率影响的响应面图

3 结 论

在单因素试验基础上，应用Design Expert 8.05软件优化刺梨单宁提取工艺参数，最优提取工艺参数是：乙醇浓度85%、超声时间40 min、料液比1∶20 (g/mL)、超声功率250 W.在上述最优提取条件下，刺梨单宁提取得率为44.98%，模型的预测值为45.86%，实际提取得率与模型预测值基本吻合，表明所建的数学模型与实际情况拟合较好，说明所选的优化提取参数可靠、稳定，为刺梨单宁的提取工艺提供科学的理论依据.