张 松，乔自林，马桂兰，刘丽霞，王家敏，侯兰新

(1.西北民族大学 生物医学研究中心 甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃 兰州 730030；2. 西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030，3.兰州民海生物工程有限公司，甘肃 兰州 730010)

MDCK细胞(犬肾细胞，Madin-Darby canine kidney cells，MDCK)系是1958年由Madin等从美国的一头Cocker Spanie母曲架犬的肾脏组织中分离得到的[1]。MDCK细胞呈上皮细胞样，容易培养、增殖快、贴壁生长，也可驯化为悬浮培养，可连续传代[2].大量研究表明，MDCK细胞对多种不同亚型的流感病毒株敏感.病毒用MDCK细胞培养的产量高等特点，可以用来代替鸡胚用于疫苗的生产[3-6]。MDCK单克隆细胞是本实验室由MDCK工作库细胞通过有限稀释法所制备，共制备114株.不同的MDCK单克隆细胞株在生长特性上有较大的差异.

本研究前期通过有限稀释法将MDCK细胞进行单克隆化，获得了自建MDCK单克隆细胞库，库内共有114株单克隆细胞.现通过复苏MDCK单克隆细胞，统计细胞复苏活率、生长状态、生长速度和生长形态等特性，确定MDCK单克隆细胞库的可用性，旨在为后期筛选病毒敏感的MDCK单克隆细胞实验提供资源和理论参考，为流感疫苗的生产提供参考.

1 材料和方法

1.1 MDCK单克隆细胞

MDCK单克隆细胞由本实验利用MDCK工作库细胞(MDCK-W-63)通过有限稀释法筛选获得，共114株.

1.2 主要试剂

DMEM培养基、0.25%胰酶和PBS(兰州百灵生物技术有限公司)；胎牛血清(兰州民海生物有限公司)；台盼蓝(广州展晨生物科技有限公司).

1.3 主要仪器设备

CO2细胞恒温培养箱(上海博讯公司)、生物倒置显微镜(日本奥林巴斯光学科技有限公司)、洁净操作台(苏州净化设备有限公司).

1.4 细胞培养

将储存于液氮罐中的MDCK单克隆细胞取出，在37 ℃水中快速融化后置于50 cm2培养瓶中，补加培养基(DMEM+10%胎牛血清)，再置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养.待MDCK细胞生长至致密单层时，PBS液清洗，倒出PBS后加入5 mL 0.25%胰酶，缓慢摇动细胞培养瓶，使胰酶充分没过细胞表面，将细胞放回培养箱内继续消化5 min取出，在显微镜下观察.当细胞全部变圆并开始脱落时弃去胰酶，在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中继续放置3 min后取出，并倒去胰酶加入15 mL DMEM培养基.将细胞吹打混匀后按1∶4比例传代，将细胞继续放入37 ℃、5% CO2的培养箱中培养.

1.5 细胞复苏活率

待细胞复苏后，将细胞悬液50 uL加入PE管中，加入50uL 0.5% 台盼蓝染液，染色2～3 min.吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片，镜下取任意视野细胞计数.死细胞能被台盼蓝染上色，镜下可见深蓝色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状.细胞活率 =(未着色细胞数/总细胞)×100%.

1.6 细胞生长速度、状态

如1.4中所述进行细胞复苏并培养至单层致密，将细胞密度调整为5×104个/mL传代细胞.将细胞置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，每天观察细胞两次.统计MDCK单克隆细胞长满需要的时间，以评价细胞生长速度.通过观察细胞的边缘清晰程度、整齐程度与大小差异来评价细胞生长状态.

1.7 细胞的生长形态

如1.4中所述复苏细胞，将细胞置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，每天观察细胞两次.观察细胞复苏贴壁后细胞的生长形态并统计细胞生长形态的种类.

2 结果

2.1 MDCK单克隆细胞的复苏活率

MDCK单克隆细胞库内114株MDCK单克隆细胞株复苏后，细胞最低活率为92.1%，最高活率为97.3%，平均活力为0.954 ±0.016，高于制备MDCK单克隆细胞所使用的工作库细胞.

2.2 MDCK单克隆细胞的生长状态和速度

MDCK单克隆细胞库内114株细胞，2 d长满的细胞株为70株，占61.4%；3 d长满的35株，占30.7%；4 d长满5株，占4.4%；超过4 d长满的4株，占3.5%. 细胞生长状态良好的细胞有66株，占57.9%, 一般的细胞有43株，占37.7%；较差的细胞共有5株，占4.4%.

表1 MDCK单克隆细胞生长速度和状态统计表

2.3 MDCK单克隆细胞形态分析

MDCK单克隆细胞共有3种细胞形态，第一类为典型的多角上皮样细胞形态，与MDCK母细胞形态一致，长满单层后呈规则石块状铺展生长，贴壁迅速.高倍镜下细胞胞质丰满，核仁清晰，如图1A所示. 第二类为梭形成纤维状细胞形态，与MDCK母细胞的形态差异较大，细胞呈梭形、长条形、不规则形，呈相互平行排列，细胞呈现成群放射状、漩涡状等形态，长满汇合至100%时细胞呈细枝状交错生长，如图1B所示.第三类为岛状样细胞生长形态，与MDCK母细胞形态的差异更大.细胞单个贴壁，相互分散生长，一般不连成片、形成集落.相邻单个细胞生长拥挤，细胞形成岛状样生长，如图1C所示.114株MDCK单克隆细胞的具体形态分布见表2，MDCK单克隆细胞中多角上皮样细胞形态细胞有78株，占68%；成纤维样细胞有13株，占12%；岛状样细胞有23株，占20%.

表2 MDCK单克隆细胞形态表

A. 多角上皮样细胞(×100)；B.梭形成纤维样细胞(×100)；C.岛状样细胞(×100)

3 讨论

流感对人类健康威胁严重，及时接种疫苗是预防流感最有效的方法[7].目前，获准生产人用流感疫苗的细胞系主要有 Vero细胞和MDCK细胞[8].近年来使用MDCK单克隆细胞生产流感疫苗获得很大发展[9].有限稀释法是制备MDCK单克隆细胞经济有效的方法，其通过细胞稀释至每孔只有单个细胞后进行培养而获得单克隆化细胞株，所制备的MDCK单克隆细胞株在生长特性上有较大差异.基于此，通过复苏MDCK单克隆细胞株，统计所有细胞的生长速度、生长状态以及细胞形态类型及其数量，确定制备的MDCK单克隆细胞库的可用性.

MDCK细胞作为生产流感疫苗的基质，其培养好坏直接影响着流感病毒的筛选[10].细胞生长好坏可通过细胞的活率、生长状态、生长速度、生长形态来综合评价，活率高、状态好、速度快、形态均一的细胞更适用于科学研究.细胞复苏后经过培养可以修复损伤的细胞膜功能[11]，细胞活率在复苏培养过程中可以得到显著提高.本实验室自建MDCK单克隆细胞库细胞平均复苏活率达0.954 ±0.016%，与细胞冻存前后活率差异不大，但比MDCK母细胞活率高.细胞的生长速度是提高实验效率的重要条件，实验周期是研究人员要密切关注的问题.生长速度的提高可以缩短实验周期，筛选生长速度快的细胞就显得尤为重要.MDCK单克隆细胞库中大多数细胞均可在2～3 d长满，有利于实验快速有效地开展，缩短了实验周期.细胞的生长状态也是影响实验成功与否的重要因素，生长状态好的细胞更加有利于得到理想的实验结果，MDCK单克隆细胞库中生长状态良好的细胞占比为57.9%，可为实验提供可靠的细胞资源.细胞形态的多样性可以用来评价MDCK单克隆细胞库细胞的丰富性.本研究中MDCK单克隆细胞具有三种细胞形态.

前期实验自制的MDCK单克隆细胞库内细胞复苏活率高，生长速度快，状态良好，库内细胞有三种形态，可为后续甲型H1N1流感病毒筛选实验提供敏感细胞基质，为筛选提供丰富的资源，并为流感疫苗的生产参考依据.