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(1 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室，中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东 青岛 266071；2 青岛市鱼类种子工程与生物技术重点实验室，山东 青岛266071；3 青岛海星仪器有限公司，山东 青岛 266000；4 中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所，上海200092；5 上海海洋大学，水产与生命学院，上海 201306)

目前国内尚无对于石斑鱼听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)的研究报道，本研究利用自主构建的ABR检测系统对珍珠龙胆石斑鱼的听觉阈值和听频范围等指标进行检测，研究结果将为研究水下噪声对石斑鱼类的潜在影响以及相应的环境优化提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

20条体长32～35 cm的珍珠龙胆石斑鱼购自烟台养殖基地，每次试验前静养2～3 d。麻醉试验根据相关论文[3]进行了改进和优化，采用背鳍基部注射加拉碘铵 (Gallamine triethiodide,购自Sigma-Aldrich公司)， 使用剂量为(1.25±0.13) μg/g 鱼体质量，对试验鱼实施麻醉。在该剂量麻醉剂的作用下，麻醉状态可持续2～3 h，且基本没有全身性的肌肉收缩，排除了试验过程中肌电的干扰。

1.2 仪器及ABR检测系统的组成

试验所用的ABR 检测系统参照相关文献[3-6]并进行了构建和优化，所需仪器见表1，系统原理示意图见图1。水槽材质为有机玻璃，尺寸为120 cm×50 cm×50 cm，水下扬声器距水面25 cm。将水槽置于防震台上，通过固定装置将麻醉后试验鱼的身体基本没于水槽水面以下，并使水位保持低于石斑鱼头盖骨2 cm左右。在水槽中放置1台小型循环加氧泵，通过软管将富氧水流入鱼口中，保证正常供氧。系统进行检测时，首先使用医疗纱布蘸取蒸馏水擦拭鱼的头骨皮肤3～5次，待鱼表皮干燥后采用固定于防震台上的电极操纵器(WPI M3301,WPI)，将记录电极精准定位于两眼上头骨中缝的听神经位置，参考电极定位于记录电极前方两眼中间的位置，两个电极均插入皮下0.5～1 mm，记录电极和参考电极接地后连接至生物电信号放大器(ISO-80,WPI)，在鱼尾部肌肉中插入接地电极，以防止鱼体肌电造成的干扰。

表1 主要试验仪器

图1 ABR 检测系统示意图

1.3 参数设定

水下声音信号由信号发生器(DG1022U，普源，中国)产生纯短音信号，经过前级和功率放大器(A-9030， 安桥，日本)将信号放大之后由水下扬声器给出。通过信号发生器设置声音输出模式，声音信号时程根据频率的不同设置为10～20 ms，间歇3 s，记录时长50 ms，测试石斑鱼100、200、300、500、800、1 000、1 500、2 000、3 000、5 000、10 000 Hz各频率的AEP阈值(AEP单位为dB)。刺激信号声强从高到低，以5 dB递减，接近阈值时，每次减小2 dB，直至确定阈值。刺激声强度由最高160 dB，再以5 dB依次递减。滤波范围为100 Hz～1 kHz，叠加1 000次[3]。声压水平(SPL)的校准和水下背景噪声的记录使用水下声音记录仪(Soudtrap 300HF，Ocean Instruments，新西兰)和水听器(中船重工726所自制，型号：RST-32，工作频率范围：20 Hz～50 kHz，低频接收灵敏度：≥-202.7 dB)辅助完成，使用1 μPa为水下参考声压，测量实际声压并完成修正后得到正确声压值。

通过放大器将石斑鱼的听觉诱发电位(AEP)，放大10 000 倍后输入四通道24位同步数据采集卡进行模数转换，导入电脑，使用采集卡配套软件记录数据。每个频率、每个强度的试验过程均重复2次，以确定获得的ABR 具有二次重复性，能够获得可重复ABR 波形的最小声压级，即为该频率下的听觉阈值。通过多次重复后对结果进行平均，能够消除单次试验误差和环境噪声信号的干扰。本研究在对试验结果重复500次时,已经能够得到较理想的ABR曲线，最终选择1 000 次重复作为本研究的最终结果。

1.4 数据处理

采用Clampfit 8.1软件分析处理试验中记录的ABR数据,通过Sigmaplot 12.0作图和SPSS统计软件(SPSS Inc.)进行统计分析。

2 结果

2.1 珍珠龙胆石斑鱼ABR 波形特点

共对20 尾珍珠龙胆石斑鱼进行了ABR 测试，结果显示，20尾鱼均对100 Hz～10 kHz纯音有较明确的响应，且能够记录到放大后的AEP。在100 Hz～10 kHz的频率范围内，ABR 波形存在1个较明显的负向主波峰和1个正向主波峰，如200 Hz 95 dB刺激下的ABR 波形(图2)；并且在特定频率范围内还会在正向主波峰后伴随1～3个小型正向波峰(图3)。每个AEP信号的响应潜伏期为3～6 ms，并且响应潜伏期的时间会随着刺激声强度的增强而呈现缩短的趋势，每增强10 dB，约缩短0.1～0.3 ms，但潜伏时间对于频率的变化并不敏感 (图3)。对照组的死亡石斑鱼在同样声音刺激下，没有记录到AEP信号。

图2 200 Hz的珍珠龙胆石斑鱼的ABR 波形

图3 不同频率、声强刺激下的珍珠龙胆石斑鱼的ABR 波形

2.2 珍珠龙胆石斑鱼的ABR听觉阈值曲线

应用构建的ABR检测系统，20条石斑鱼在100～5 000 Hz的听频范围内均记录到短纯音诱发的AEP信号，将每一频率的阈值平均，绘制出鱼在各频率下的听觉阈值曲线(图4)。经过分析，鱼的最适听频范围为100～2 000 Hz，最敏感的声音频率为300 Hz，听觉阈值约为75.8 dB。

图4 珍珠龙胆石斑鱼听觉阈值曲线

3 讨论

3.1 鱼类听觉能力测定的方法

鱼类的听觉特性包括听觉阈值、环境噪声对鱼类听觉的遮蔽效果、音频辨别能力、声源定位能力、对学习音的记忆力等[7]。听觉阈值是指鱼类刚能听到声音的最小声压值,是鱼类最基本的听觉特性，目前对于鱼类听觉阈值进行测定的方法主要分为行为学、电生理学和神经电位测量3种手段。行为学研究主要是根据鱼类对声音刺激的条件反射，判断鱼类对刺激声音的反应以及阈值；电生理学研究是通过对鱼进行驯化,将声音刺激和电击相结合，使鱼对刺激产生条件反射,然后只采用声音刺激并根据心电图或鳃盖运动的变化判断鱼对声音的反应；神经电位测量则通过采集鱼的中枢神经系统发出的动作电位，根据电位的变化判断鱼对声音刺激的反应，测定鱼类的听觉阈值[8]。

采集听性脑干反应(ABR)作为一种非侵入性的神经电位研究方法，其原理是收集由声音引起的第8神经及脑干听觉核的同步神经电位[9-10]。ABR技术优点是能够实现无创伤、快速、反复测定听力，对试验鱼大小无要求，能够对不同种类鱼类的听觉进行研究[4]，但是ABR技术对试验环境特别是电磁环境要求极其严格。试验结果还经常会受到背景环境噪声的干扰,在不同环境下使用不同检测仪器时，结果往往会有所差别[3]。尽管如此，凭借非侵入性检测手段的巨大便利，听性脑干反应(ABR)从1998年被应用于鱼类听力研究以来，该技术被迅速推广[4,11]。国内鱼类听觉电生理研究发展较晚，目前研究水平还相对落后，该领域的报道还仅见于胭脂鱼(Myxocyprinusasiaticus)、斑马鱼(Daniorerio)和褐菖鲉(Sebasticusmarmoratus)等淡水鱼类[3,6,12]。

3.2 石斑鱼类的听觉阈值特征

目前,石斑鱼属鱼类的听觉研究资料十分匮乏,仅有1999年韩国科学家Yang等[13]采用心电图(ECG)技术对七带石斑鱼(Epinephelusseptemfasciatus)的听觉阈值进行了研究，在100～1 000 Hz的频率范围内，七带石斑鱼的听觉曲线呈“U”形，其最佳听觉频率为350Hz，阈值为94.8 dB。本研究中，珍珠龙胆石斑鱼的听力曲线与报道的七带石斑鱼的听力曲线十分相似，但最佳听力频率和阈值均有所不同，分析原因，可能既与试验鱼的大小、来源等有关，也与两项研究中所采用的鱼类听觉检测技术在性能上的差异有关。根据Takahito等[14]使用听性脑干反应(ABR)和心电图(ECG)技术测定鲤鱼(Cyprinuscarpio)听觉阈值的研究结果，ABR测得的最敏感频率为505 Hz,而用ECG测得的最敏感频率为1 000 Hz，尽管使用ABR技术和ECG技术得到的听觉图的形状相似,但两个图中阈值水平有所不同。张旭光等[12]比较了褐菖鲉在行为听觉和听觉诱发电位反应的差异，发现行为听觉获得的敏感频率范围为80～300 Hz，其中对100 Hz声音最为敏感,对应的听觉阈值为90 dB，而ABR获得的试验结果为：敏感频率范围100～300 Hz，其中150 Hz为最敏感频率，对应阈值为70 dB，行为听觉曲线与听觉诱发电位法所得到的褐菖鲉听觉曲线基本相似。与鲤鱼和褐菖鲉相似，本研究利用ABR技术获得的珍珠龙胆石斑鱼的最敏感听觉频率为300 Hz，阈值为75.8 dB，也低于采用ECG技术获得的七带石斑鱼最佳听觉频率(350 Hz)和阈值(94.8 dB)的试验结果，以上试验结果能够在一定程度上反映ABR和ECG技术的差异和各自特点。目前大多数鱼类的ABR听觉曲线为“U”形，如鲫鱼(Carassiusauratus)[4]、橙鳍沙鳅(Botiamodesta)[15]、胭脂鱼等[3]；少数鱼类的ABR听觉曲线为直线形，如地图鱼(Astronotuscellatus)[4]；极少数鱼类呈现“W”形，如美洲鲥(Alosasapidissima)[16]。

3.3 石斑鱼类的听觉能力与其他鱼类的比较

鱼类的听觉器官有两种类型：一种与鳔不相连接；另一种与鳔相连接，使鳔成为听觉器官的一部分，特别是鲤科鱼类。有一个称为魏勃氏器(Weberian apparatus)的器官，是由脊柱前端的数个骨所形成，借鳔连接内耳，具有听骨的功用。鳔壁的振动，借着魏勃氏器的传导而形成具有一定频率与强度的波动，再传入鱼的内耳。通常认为，骨鳔鱼类听觉最敏感，非骨鳔类次之,无鳔类听觉能力较差，有鳔鱼类相比无鳔鱼类具有更宽的听频范围和更低的听力阈值[6]。因此，可以认为鳔不仅使鱼类听觉敏锐，也扮演着扩大声音频率范围的角色[17]。刘猛等[3]研究发现，胭脂鱼的听频范围为100～5 000 Hz,100～2 000 Hz范围敏感度较高,800 Hz最敏感,听觉阈值约69.8 dB。Kenyon等[4]研究发现金鱼(Carassiusauratus)的听频范围为100～5 000 Hz，最低阈值为64.0 dB。鲢(Hypopthalmichthysmolitrix)和鳙(Aristichthysnobilis)的听频范围为100～3 000 Hz，鲢的最低阈值为104.2 dB,鳙的最低阈值为105.7 dB[18]。石斑鱼类作为一种有鳔鱼类，其听频范围为100～5 000 Hz,最适听频范围为100～2 000 Hz，这一范围基本与大多数鱼类的听觉频率接近，属于低频声响。有鳔的杜父鱼(Pseudoblenniuscottoides)的听频范围为40～6 000 Hz，而Mann等[16,19]研究发现鲱形目的美洲鲥(Alosasapidissima)和大鳞油鲱(Brevoortiapatronus)甚至可以听到高达180 kHz的超声波。底栖无鳔的牙鲆(Paralichthysolivacues)则对60～200 Hz 的低频音较敏感，最敏感频率为100 Hz，其听觉阈值为(94±1.5) dB[20]。而没有韦伯氏器的鱼类,如鲈形目鱼类，虾虎鱼(Gobiuscruentatus) 阈值均高于108 dB，而且听频范围窄,不超过1 000 Hz[21]。

3.4 麻醉剂对鱼类ABR研究结果的影响

在检测鱼类脑干电信号的过程中，使用不同类型的麻醉剂以及不同剂量会对试验结果产生影响。潘豪来等[6]采用0.01%和0.1%的三卡因甲基磺酸盐(MS-222)对斑马鱼进行短暂麻醉和深度麻醉后，应用AEP检测系统记录不同时间点的AEP，结果表明，过度麻醉会导致响应波形潜伏期延长、幅值下降，相反，麻醉程度变浅后所记录的斑马鱼响应波形潜伏期缩短、幅值升高。而Kenyon等[4]发现使用加拉碘铵作为麻醉剂不会对金鱼ABR产生影响。Yan等[22]、Cordova等[23]的研究也证实使用加拉碘铵作为麻醉剂不会对鱼类的ABR产生影响。根据以上研究报道，本试验中也将加拉碘铵作为珍珠龙胆石斑鱼的麻醉剂，并根据鱼体质量和预试结果对使用的剂量进行优化，也为今后开展更大规格石斑鱼以及其他大型海洋游泳性鱼类的麻醉剂剂量使用提供参考。

4 结论

石斑鱼是中国沿海养殖的高值鱼类代表，属于趋触性岩礁鱼类，喜栖息于鱼礁孔隙中，特别的生活习性使其既适合于工厂化高密度养殖，也适合于人工鱼礁增殖。随着近年来石斑鱼人工繁殖和养殖技术的突破，石斑鱼养殖规模不断扩大，池塘、网箱、陆海接力、工厂化循环水、深远海养殖工船等养殖模式不断涌现。本研究建立的珍珠龙胆石斑鱼听性脑干反应(ABR)检测系统和初步获取的听觉阈值，以及珍珠龙胆石斑鱼的听性脑干反应(ABR)听觉曲线能够为研究噪声对不同养殖模式下石斑鱼的动物福利提供重要的试验数据，在下一步研究中还需要对ABR检测系统进行改进和优化，提高检测系统的抗干扰能力和稳定性。与此同时，也需要对不同体型和不同生长阶段的石斑鱼进行研究，如石斑鱼苗种和亲鱼等，以更好地评估噪声对养殖石斑鱼健康生长的影响。

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