孔令伟 时敬文 胡金 董官波

（弘和制药有限公司 吉林 梅河口 135000）

银杏叶提取物制剂为静脉注射剂，由银杏叶提取物及部分辅料制成的灭菌水溶液，其主要成分为总黄酮、萜类内酯。其中总黄酮及萜类内酯为银杏叶提取物的主要成分，因为中药成分的复杂性，其质量标准均对主要成分的含量进行检测，其中银杏内酯具有抑制血小板聚集作用[1]，对中风、老年痴呆症等疾病具有明显功效[2]，因此其含量检测方法成为内酯研究的热点，本文通过使用高效液相色谱法检验银杏内酯A、B、C、及白果内酯来指征银杏总内酯的含量，并对该方法进行方法学验证，结果表明该检验方法可用于产品的质量控制。

1.仪器和材料

Agilent 1260液相色谱仪，蒸发光散射检测器（ELSD，Agilent公司)，甲醇为色谱纯（Fisher公司）；梅特勒-托利多十万分天平（型号MS105DU）；其余试剂均为分析纯。

银杏叶提取物制剂为某制药公司提供（批号：20170501，20170610）；白果内酯（批号110865-201507）、银杏内酯C（批号110864-201508）银杏内酯A（批号110862-201612）、和银杏内酯B（批号110863-201611）由中国食品药品检定研究院提供。

2.溶液制备

2.1 对照品溶液的制备：

取白果内酯、银杏内酯C、银杏内酯A、和银杏内酯B对照品适量，用75%甲醇配成每1ml分别白果内酯、银杏内酯C银杏内酯A、和银杏内酯B对照品0.2mg、0.3mg、0.3mg和0.1mg的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备：

精密量取装量项下供试品溶液30ml，置50ml具螺纹盖离心管中，加入乙酸乙酯20ml，旋紧盖子，混匀，打开，放气，再旋紧盖置涡旋振荡器中振荡1分钟，离心（2000转/分钟）10分钟，吸取乙酸乙酯置蒸发皿中，再加入乙酸乙酯5ml，重复操作5次，合并6次乙酸乙酯液，于80度水浴中蒸至近干，用4ml甲醇分次转移至10ml离心管中，小心吹干甲醇，再精密加入75%甲醇0.5ml，涡旋使溶解，过0.22um的滤膜，取续滤液；或高速离心取上清液，即得。

3.色谱条件

Agilent ZOBAX SB-C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）色谱柱，柱温为35℃，以甲醇：0.1%甲酸（20∶80）为流动相进行洗脱。蒸发温度为120℃，雾化温度为90℃，载气流速为1.1ml/min。进样量：分别精密吸取对照品溶液3μl～10μl及供试品溶液5～10μl，注入液相色谱仪。

4.方法学考察

4.1 方法学摸索

4.1.1 由于每1ml制剂产品中仅含0.16～0.17mg银杏叶提取物，推算其萜类内酯含量约在5～10μg/ml，含量较低，为达到检测灵敏度，需要从检测和供试品前处理两方面均考虑，尽量提高检测灵敏度，满足含量测定的定量要求。

4.1.2 色谱条件的确定

（1）蒸发光散射检测参数

研究发现，蒸发光检测器的蒸发温度和雾化温度越高，4种待测成分的响应就越高；待测成分的响应随着气体流速的降低而升高，至1.1ml/min时，响应最高[3]。

最终蒸发光散射检测器确定参数为：雾化温度90℃，蒸发温度为120℃，气体流速为1.1ml/min。由于注射液中萜类内酯含量低，如检测器灵敏度不够可能导致无法检出，因此在标准中细化蒸发光检测器参数作为参考。

（2）流动相酸度

研究发现，流动相具有一定酸度会增强萜类内酯信号，考虑到蒸发光散射器特性，选择挥发性酸甲酸进行考察，比较水、0.01%甲酸、0.1%甲酸和0.5%甲酸作为水相与甲醇洗脱时，发现0.1%甲酸为流动相水相时响应最强，因此选择流动相为0.1%甲酸-甲醇（80∶20）。

确定色谱条件下，4种萜类内酯分离较好，供试品中无杂峰干扰4种待测成分（见图1）。

4.1.3 供试品前处理方法摸索 分别摸索了取大体积注射液，进行浓缩后再液液萃取的方法（方法1和方法2，同时比较不同溶剂提取效率）、直接取少量注射液进行涡旋萃取（方法3）、固相萃取方法（方法4）和直接液液萃取方法（方法5），具体方法如下。

（1）方法1：精密吸取装量项下供试品溶液300ml，至500ml圆底烧瓶中减压浓缩至近干，加无水乙醇100ml溶解残渣，过滤，取滤液至蒸发皿中，于水浴蒸至约2ml 转移至50ml具螺纹盖的离心管中，用无水乙醇2ml洗涤蒸发皿转移至同一离心管中，再量取水10ml清洗圆底烧瓶同样转移至同一离心管中，用乙醚约20ml清洗上述蒸发皿，转移至同一离心管中，旋紧盖子后混匀，打开盖放气，再旋紧盖置至涡旋振荡器中振荡1分钟，离心（3000转/分钟）5分钟，分取上层乙醚液体至蒸发皿中，再加入乙醚20ml，按照上述提取步骤提取，分离乙醚，重复操作4次，合并5次提取的乙醚液，室温挥至近干，加甲醇定容至5ml。

图1 注射液中萜类内酯含量测定色谱图

（2）方法2：精密吸取装量项下供试品溶液300ml，至500ml圆底烧瓶中减压浓缩至近干，加无水乙醇100ml溶解残渣，过滤，取滤液至蒸发皿中，于水浴蒸至约2ml转移至50ml具螺纹盖的离心管中，用无水乙醇2ml洗涤蒸发皿转移至同一离心管中，再用水10ml清洗圆底烧瓶同样转移至同一离心管中，用乙酸乙酯约20ml清洗上述蒸发皿，转移至同一离心管中，旋紧盖子后混匀，打开盖放气，再旋紧盖置至涡旋振荡器中振荡1分钟，离心（3000转/分钟）5分钟，分取上层乙酸乙酯液体至蒸发皿中，再加入乙酸乙酯20ml，按照上述提取步骤提取，分离乙酸乙酯，重复操作4次，合并5次提取的乙酸乙酯液，室温挥至近干，加甲醇定容至5ml。

（3）方法3：精密吸取装量项下供试品溶液30ml，置50ml具螺纹盖的离心管中，加25%盐酸2滴，加入乙酸乙酯10ml，旋紧盖子后混匀，打开盖放气，再旋紧盖置涡旋振荡器中振荡1min，离心（3000转/min）5分钟，取上层乙酸乙酯置蒸发皿中，再加入乙酸乙酯5ml，按上述提取步骤提取，分离乙酸乙酯，重复操作4次，合并5次提取的乙酸乙酯液，置80度水浴中蒸至近干，用3ml甲醇分次洗脱至10ml离心管中，吹干甲醇后，再精密加入50%甲醇0.5ml，涡旋使溶解，离心，取上清液，即得。

（4）方法4∶精密吸取装量项下供试品溶液50ml，过经活化后的固相萃取柱(Waters HLB 6CC，使用前加6ml甲醇过柱，弃去甲醇，再加6ml水过柱，弃去水进行活化；流速：1滴/秒；)，弃去已过柱的供试品，量取乙酸乙酯6ml洗脱固相萃取柱，收集乙酸乙酯洗脱液，至10ml具螺纹盖的离心管中，吹干，精密加入甲醇1ml，涡旋振荡溶解，离心，取上清液，即得。

（5）方法5：精密吸取装量项下供试品溶液100ml，量取乙酸乙酯40ml萃取，分取上层乙酸乙酯液体至蒸发皿中，再加入乙酸乙酯30ml按照上述提取步骤提取，分离乙酸乙酯，重复操作3次，合并4次提取的乙酸乙酯液，（每次萃取时将乳化的上层转移至50ml具螺纹盖的离心管中，离心，再吸取乙酸乙酯至蒸发皿中），置水浴上挥至近干，加3ml甲醇分次清洗蒸发皿，转移至离心管内，吹干，残渣加甲醇定容至1ml。

取上述不同前处理方法制备的供试品溶液，按照既定的色谱条件进样分析，结果见表。

表 不同前处理方法萜类内酯结果

结果表明：（1）大体积供试品进行蒸干后提取，供试品中白果内酯含量大大降低，可能在蒸干过程中损失；（2）方法1和和方法2分别采用乙醚和乙酸乙酯，结果表明乙酸乙酯提取效率高；（3）采用固相萃取与涡旋提取两种方法，提取效率最高；（4）研究中按照方法4固相萃取法采用另一家品牌的固相萃取柱（爱捷尔）进行前处理，结果均未检出4种萜类内酯，方法耐用性受色谱柱品牌所限。

综上，涡旋提取法提取效率高，且操作简便，快速，故选用该法作为前处理方法，银杏叶提取物制剂中萜类内酯含量测定检验方法可用于银杏叶提取物制剂萜类内酯含量的质量控制，该方法线性在0.9994～0.9999范围内，准确性、灵敏度均较高。