徐媛 郭遥 袁斯明 王慜 陈海妮 沈卫民

幼儿血管瘤（Infantile hemangioma，IH）是儿童最常见的良性肿瘤之一，多发于头面部[1]，严重时对儿童的外观影响较大。该病具有一个独特的自然消退过程，瘤体通常会在出生后6个月内迅速增长，大部分会在1岁之后自行消退，这一过程始终伴随着脂肪形成的现象[2]。

Khan等[3]的研究揭示了血管瘤的起源细胞可能是一群特殊的间充质干细胞，即血管瘤来源间充质干细胞 （Hemangioma-derived mesenchymal stem cells，Hem-MSCs），我们的前期研究也已证实Hem-MSCs是瘤体消退过程中脂肪形成的细胞基础[4]。在血管瘤病理演变过程中必然伴随着脂肪分化相关基因表达的变化，其中PPAR-gamma基因是控制间充质干细胞向脂肪细胞分化的关键基因[5]。研究证实，PPAR-gamma的激动剂罗格列酮能促进BMSCs成脂分化过程[6]。因此，我们推测罗格列酮亦可能通过激活PPAR-gamma信号通路，从而影响Hem-MSCs的成脂分化过程。

本研究旨在探讨罗格列酮对Hem-MSCs成脂分化的影响，从而为罗格列酮应用于IH患儿，以加速其血管瘤消褪进程提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本

瘤体标本取自南京市儿童医院烧伤整形科，系临床手术切除的增生期新鲜婴幼儿血管瘤标本，共9例，均经患儿父母授权同意。

1.1.2 主要试剂与仪器

DMEM、青链霉素溶液（Hyclone，美国），FBS、胰蛋白酶（Gibco，美国），罗格列酮原粉（天津武田），GW9662（Merck，美国），胰岛素、地塞米松、异丁基-甲基黄嘌呤（Sigma，美国），吲哚美辛（华中药业），PCR引物（吉凯基因），Matrigel基质胶（BD，美国），Perilipin A抗体（Abcam，美国），油红干粉（Amresco，美国），MaxVisionTM即用型免疫组化检测试剂盒（迈新生物）。

倒置相差显微镜（重庆奥特），显微摄像头（Jenoptik，德国），流式细胞仪（BD-FA6Calibur，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

参考文献[7]的方法，采用贴壁培养法分离培养Hem-MSCs。去除标本上多余的皮肤和脂肪组织，完整剥离出瘤体，将肿瘤组织剪碎成约1 mm3的小块，均匀分散地贴于6 cm培养皿中，加入L-DMED/10%FBS培养基，37℃、5%CO2下培养4 d，随后隔天更换培养基，直至组织块周围爬出间充质干细胞；去除组织碎片及悬浮细胞，将贴壁细胞继续培养扩增，传代至第3代后为纯化的细胞系。细胞定期传代扩增，冻存于液氮中备用。

1.2.2 实验分组

按不同条件培养基分5组，包括：A组（普通培养基，即L-DMED/10%FBS）、B组（1μM罗格列酮+普通培养基）、C组（成脂诱导培养基，10μg/mL胰岛素+1μM地塞米松+0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤+60μM吲哚美辛）、D组（1μM罗格列酮+成脂诱导培养基）、E组（2μM GW9662+1μM罗格列酮+成脂诱导培养基）。

1.2.3 油红O染色

将2.5 mL细胞悬液接种于六孔板中，共接种两板，每板接种5孔，细胞贴壁并进入指数生长期后按实验分组更换培养基，随后隔天换液，两板细胞分别培养至第7天和第14天。先在倒置相差显微镜下观察细胞分化情况；再用4%多聚甲醛固定后，行油红O染色，倒置相差显微镜下观察脂滴形成情况。

1.2.4 Western－blot检测

将Hem-MSCs接种于5个10 cm培养皿，进入指数生长期后按实验分组更换培养基，随后隔天换液，培养直至细胞密度达到80%。定期观察，培养2周后，收获细胞进行检测。将细胞收集到EP管中，加入裂解液，在冰上裂解15 min后超声破碎细胞，离心取上清后调整蛋白浓度至2μg/μL，将样本点入加样孔后开始电泳（浓缩胶80 mA，20 min；分离胶120 mA，1 h），电泳结束后，在4℃、300 mA恒流条件下转膜150 min，将蛋白转移到PVDF膜上，封闭液（含5%脱脂牛奶的TBST溶液）室温封闭1 h，一抗孵育2 h，TBST洗膜4次，每次8 min，后二抗孵育1.5 h，TBST洗膜4次，每次8 min，加入显色液，避光显色至出现条带，加入定影剂定影10 min至胶片透明，清洗并室温晾干后进行分析。

1.2.5 实时定量PCR

将细胞接种于6孔板（每板接种5组，共接种3板，每组各3孔），细胞进入指数生长期后按实验分组更换培养基，随后隔天换液，培养7天时收集细胞。按照说明书操作，以Trizol法抽提RNA，使用分光光度计测定所抽提RNA的浓度以及质量，RNA经反转录获得cDNA，随后以两步法进行PCR反应，每12μL PCR反应体系包括SYBR premix ex taq 6.0μL、上游引物（5μM）0.5μL、下游引物（5μM）0.5μL、模板（反转录产物）1.0μL、RNase-Free H2O 4.0μL（表1）。反应条件：起始，95℃30 s ec；两步PCR，95℃5 sec，60℃30 sec，共40个循环；分离，95℃15 sec，60℃30 sec，95℃15 sec（图1）。相对定量分析F=2-ΔΔCt（ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值；-ΔΔCt=NC组ΔCt平均值-各样品ΔCt值；2-ΔΔCt反映各样品相对NC组，即A组第1周第1组，样品目的基因的相对表达水平）。

1.3 统计学分析

采用SPSS19.0软件对实验结果和数据进行统计分析。数据以表示，运用单因素方差分析和t检验行相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

图1 两步法RT-PCR熔解曲线Fig 1 Two-step RT-PCR melting curve

2 结果

2.1 油红O染色

培养至第7天和第14天时，A组和B组的细胞均未见明显脂肪分化。进行成脂诱导的另外3组在培养第7天时即可观察到脂滴形成，第14天时成脂分化的细胞数量明显多于第7天时；其中D组细胞成脂分化更加明显，可见大量成串的脂滴形成；E组的成脂分化程度明显低于D组，但接近C组。油红O染色发现，D组的染色面积明显大于C、E组（图2）。

2.2 Western－blot检测

A、B组的perilipin A蛋白的表达量极低，C组和E组的蛋白表达量稍高，D组的蛋白表达量明显高于其他4组（图3）。

2.3 实时定量PCR

分别于第1周和第2周时检测各组细胞脂肪分化相关基因（CEBPA、LPL、PLIN1、PPARG）的表达情况，每种基因均以第一周A组的基因表达量为对照值，以比较相对表达量。结果显示，各基因在A组和B组的相对表达量均极低，且在两个时间点上无明显变化（P＞0.05），而C组和E组的基因相对表达量相当，均较A组和B组稍高（P＜0.05），第2周时C组和E组的基因表达量均有所上升但增长并不明显。D组的基因相对表达量明显高于其他4组，而且相比第1周，其第2周时的基因表达量有明显增长（P＜0.05）（图4）。

图2 各组细胞形态观察Fig．2 Morphological observation of cells in each group

图3 Western-blot检测各组Perilipin A蛋白表达情况Fig.3 The expression of Perilipin A protein in each group detected by Western-blot

3 讨论

间充质干细胞的成脂分化是一个非常复杂的过程。目前的研究结果认为，脂肪分化的调控基因主要包括PPAR-gamma、CEBPA、LPL和ADD1等[8]。其中，PPAR-gamma的高表达能正向调控脂肪细胞形成的过程，是脂肪分化过程中不可或缺的，这种调控作用主要在脂肪分化的早期阶段[9]。

Yu等[10]的研究证实，Hem-MSCs能够高表达PPAR-gamma基因，我们的前期研究证实，PPARgamma基因在血管瘤消退期和消退完成期均大量表达，说明PPAR-gamma信号通路参与了血管瘤消退过程[4]。相关研究也证实PPAR-gamma的激动剂罗格列酮能促进BMSCs的成脂分化过程[6]。因此，我们推测这种促进作用对于Hem-MSCs同样有效。

在体外的细胞诱导分化实验中，我们发现在未给予脂肪分化诱导培养基的组别中，给予罗格列酮药物刺激并不能促使细胞进入脂肪分化过程，而在脂肪分化诱导培养基条件下，罗格列酮给药组能够观察到大量分化的脂肪细胞，油红O染色也显示该组中有大量成串的脂滴形成，且在给药到第2周时我们能观察到更多脂滴形成，较第1周时明显增多。

Western－blot检测显示，A、B组中仅有极少的Perilipin A蛋白表达，而在给予成脂分化诱导培养基的另外3组中，加入罗格列酮可使Perilipin A蛋白的相对表达量明显增长。

我们通过实时定量PCR，检测了成脂分化相关基因（CEBPA、LPL、PLIN1和PPARG等）的表达情况，结果也证实罗格列酮能够促进Hem-MSCs中成脂分化相关基因在脂肪分化各阶段的高表达。

本实验还证实了GW9662拮抗组能抑制了罗格列酮对Hem-MSCs成脂分化的影响，也进一步说明了罗格列酮的相关促进作用是通过PPAR-gamma信号通路来实现的。

本研究结果显示，罗格列酮单纯激活PPARgamma信号通路并不能启动Hem-MSCs的成脂分化过程，而是在Hem-MSCs已经具备成脂分化微环境的前提下，通过在成脂分化早期促使PPAR-gamma基因高表达，从而调控其他下游基因的表达，以达到促进成脂分化的结果。

图4 PCR检测不同时间点各组Hem-MSCs细胞成脂肪分化基因的相对表达量Fig.4 Detection of relative expression of adipogenic differentiation genes in hem-MSCs cells at different time points by PCR

有研究表明，IH瘤体内的内皮细胞与Hem-MSCs接触时会通过wnt信号通路抑制Hem-MSCs的成脂分化[11]，而wnt信号通路主要是通过抑制PPARγ和CEBPA两种基因的表达来达到抑制成脂分化的效果[12]。当IH进入消退期时，内皮细胞大量凋亡，这种抑制作用消失，Hem-MSCs逐渐进入成脂分化进程，这是IH的自然消退过程。本研究结果证实罗格列酮可促进Hem-MSCs在体外的成脂分化过程，该促进作用是通过激活PPAR-gamma信号通路来实现的，且在这一过程中明确提高了CEBPA和PPARG基因的表达。因此，我们认为罗格列酮能够加速IH的消退进程。

IH的消退过程包括内皮细胞的大量凋亡和Hem-MSCs的成脂分化两个重要方面，目前我们的研究仅是体外实验，罗格列酮在体内是否同样能够发挥这样的促进作用，是否同时能够加速内皮细胞的凋亡，最终加快IH的消退过程，则需要进一步的研究去证实。