真菌毒素的脱毒进展

2019-04-01张雪洁安娜高艺璇徐浩郭一飞

药学研究 2019年2期

张雪洁，安娜，高艺璇，徐浩，郭一飞

(1.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，黑龙江哈尔滨 150076；2.中国医学科学院，北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193)

霉菌的种类繁多，目前约已发现45 000种，其中约有200多种能产生毒霉菌，约有50种霉菌可引起人畜中毒。主要的霉菌毒素种类有黄曲霉毒素(AFs)、玉米赤霉烯酮(ZEA)、T-2 毒素(T-2 toxin)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、赫曲霉毒素(OTA)、烟曲霉毒素(Fum)等。真菌毒素普遍存在于饲料、谷物、食品及中药材中，其毒性根据毒素的剂量、暴露持续时间、所处的环境和处理因素而变化[1]。霉菌毒素摄入可能对人和动物引起各种慢性和急性效应，例如肝毒性、遗传毒性、免疫抑制、肾毒性、致畸或致癌作用。

美国、欧盟、日本、韩国、中国等地区对于上述真菌毒素的检测在食品中已制定了相应的标准，而欧盟及美国等国家更是做出了严格的限量规定(见表1)。目前，我国对于食品及药品中真菌毒素的检测标准与国外基本相同，检测方法也较为先进。2017年，国家颁布食品安全国家标准GB 2761—2017，《食品中真菌毒素限量》规定了食品中黄曲霉毒素B1和M1、DON、展青霉素、OTA、ZEA等6种真菌毒素的限量标准。国内外对于真菌毒素的安全性问题认识较早且较深刻，各种限量标准也建立的较完善，监督和检测方面均已建立成熟的体系。但由于中药成分复杂，且真菌毒素种类众多，不同毒素的危害性各不相同，为了用药安全并减少不必要的损失，需要对于中药材中真菌毒素定性定量检测之后，进行真菌毒素的脱除[2]。

对于真菌毒素的脱除，现在常用的脱除方法按照作用机理大致可分为物理脱除、化学脱除及生物降解。物理脱除主要包括吸附、分选等；化学脱除则是利用化学反应改变真菌毒素的结构，降低其毒性，进而实现脱毒；生物降解是利用微生物或酶进行脱毒。

1 物理脱除

物理吸附是利用一些具有吸附性质的材料如沸石等对毒素进行吸附。其机理是吸附剂与毒素在动物体内结合形成复合体，使毒素在体内经过消化道时不被吸收而排出体外，减少机体、血液和靶器官中的毒素含量，从而减弱毒素的毒害[3]。

表1 中国、欧盟及美国对真菌毒素的限量标准(μg·kg-1)

注：“-”表示没有明确限量要求

1.1 脱除材料目前文献报道的主要有以下几种。

1.1.2 膨润土膨润土是一种廉价的非营养性非选择性多价螯合剂，对污染物具有很高的吸附能力，通常用作饲料添加剂，其机理是在胃肠道中吸附毒性降低生物利用度，从而降低黄曲霉毒素的毒性。可以有效预防黄曲霉毒素。近年来，研究人员不断改进膨润土的结构以提高膨润土的吸附能力，并且在这方面已有许多报道。Nones等[6]用两种有机盐-苯扎氯铵和十六烷基三甲基溴化铵处理膨润土，使膨润土的层间间隔增大，对AFB1的吸附能力显著提高。此外，这两种材料可能保护神经嵴干细胞免受AFB1造成的损害。Nones等[7]是通过掺入锌离子来改性巴西膨润土，膨润土的锌处理增加了AFB1的吸附，从而降低黄曲霉毒素的毒性，且对成纤维细胞等正常细胞没有毒性。

1.1.3 蒙脱石蒙脱石是一种具有较高的离子交换容量及吸水膨胀能力的硅铝酸盐。将它应用于吸附真菌毒素，取得了良好的效果。Wang等[8]通过实验证明，精炼钙蒙脱石粘土边缘处的表面羟基层在基面上具有永久的负电荷，对AFB1和FB1有良好的吸附效果。Bekci等[9]发现蒙脱石K10和柱撑蒙脱石K10可吸附ZEA。

1.1.4 介孔分子筛介孔分子筛SBA-15具有二位六方通孔结构，其表面积大，在分离、催化剂纳米组装等方面具有很大的应用价值。Appell等[10]研究了丙硫醇官能化的SBA-15对霉菌毒素污染的水溶液的吸附。丙基硫醇改性的SBA-15在低pH及加热至60 ℃，可显著降低受污染样品中展青霉素的水平。

1.1.5 大孔树脂大孔树脂是一种具有高分子的聚合物吸附剂，以吸附为特点，对有机物具有浓缩、分离作用。它主要是利用聚合基元、交联剂、致孔剂、分散剂等经聚合反应制备而成。这类聚合物具有高孔隙率，利用孔穴吸附有机物，实现分离纯化。崔丽丽等[11]合成新型大孔吸附树脂 LKS-11，利用大孔吸附树脂的选择吸附性能等优点，分析不同来源的人参提取物中农药腐霉利的脱除效果。LKS-11对人参、西洋参提取物中的腐霉利具有良好的吸附性能，腐霉利脱除率和产品回收率均在90% 以上。

1.1.6 纤维素纤维素是一种大分子多糖，广泛的分布于自然界中，由于其分子中具有丰富的羟基，可通过分子间氢键吸附真菌毒素。Zadeh等[12]通过酸水解合成纳米纤维素，然后分别用不同的游离脂肪酸修饰，通过脂肪酸与FB1疏水尾部发生亲酯相互作用，FB1的毒性大大降低。这些新型吸附剂可与不同食品一起用于去除FB1。

1.1.7 壳聚糖壳聚糖是另外一种多糖，它是由自然界中几丁质经脱乙酰作用得到的，由于其较强的吸附能力，被广泛用于水处理、金属提取及回收等领域。Liu等[13]以戊二醛为交联剂，硫脲为改性剂，制备了硫脲改性壳聚糖树脂(TMCR)，在不同pH值，温度，接触时间和棒曲霉素浓度下TMCR对棒曲霉素的吸附能力。结果显示TMCR有效清除来自水溶液的棒曲霉素。

1.1.8 其他纳米材料随着纳米技术的不断发展，将现有的材料制成纳米材料，增加材料的比表面积，从而增加其吸附能力，在真菌毒素的吸附脱除方面得到了应用。Zhang等[14]使用表面活性剂硬脂基二甲基苄基氯化铵修饰埃洛石纳米管(MHNT)，研究了MHNT从模拟胃液和模拟肠液中吸附ZEA的效率。结果表明，表面活性剂修饰的埃洛石纳米管减轻了ZEA暴露的毒性和雌激素效应，包括氧化应激生物标志物和器官重量的变化，并且MHNT可以在动物饲料或胃肠道中与ZEA结合。Pirouz等[15]使用磁性氧化石墨烯纳米复合材料作为吸附剂以减少天然污染的棕榈仁饼中的镰刀菌毒素，对DON，ZEA，HT-2和T-2的吸附分别达到69.57%、67.28%、57.40%和37.17%的水平。

1.2 分选分选主要是根据物料色泽、内部结构、比重等不同，通过改变仪器参数将染病物料从正常物料中分选出来，目前通过分选去除真菌毒素技术主要包括比重分选、色差分选等。崔航使用比重去石机分选小麦中赤霉病小麦籽粒，物料流速和风速对赤霉病小麦籽粒分选效果影响显著，赤霉病籽粒含量越高分选赤霉病小麦籽粒效果越好[16]。同时，崔航也使用色选机研究了色差分选对赤霉病小麦籽粒的分选效果，结果显示色选机的精度对赤霉病小麦籽粒的分选效果影响显著，流速对赤霉病小麦籽粒的分选效果影响不显著，通过光电分选赤霉病小麦籽粒去除率高达50%。

1.3 小结物理吸附的机理主要是利用吸附材料本身具有的特性，是利用分子内部的吸力所引起的吸附，与毒素的结合相对较弱，吸附热较小，吸附和解析速度也都较快。被吸附物质也较容易解析出来，但吸附剂与被吸附物质的性质不发生变化，吸附剂可回收再利用，具有良好的环保性能。

2 化学脱毒

化学脱毒是利用某些技术或者化学物质来实现真菌毒素的降解，从而起到减小或消除真菌毒素的危害[17]，在此过程中，真菌毒素的化学结构发生变化。按照脱毒机制的差异，大致可分为热处理、辐射、电化学及化学添加剂脱毒。

2.1 热处理过热蒸汽是对饱和蒸汽定压加热的产物，也是降解真菌毒素最常用的方法。相比于传统的高温处理方法，过热蒸汽具有安全性高、无污染、热效率高、传热速度快的优点。根据热处理的机制，温度越高，真菌毒素的化学结构越不稳定，对真菌毒素的降解也越有利。但随着温度的升高，对机体的品质也会产生一定的影响。刘远晓等[18]调整蒸汽温度、处理时间和蒸汽流速后，对DON的降解率有显著提高，最高可达79.8%，最高可将DON含量为4.9 μg·g-1的赤霉病小麦中DON含量降至国家标准规定的限量范围内。虽然过热蒸汽处理对DON有较好的降解效果，但由于现有设备的局限以及过热蒸汽对小麦品质可能产生的不利影响，该方法在实际生产中的应用仍需要进一步的探索和研究。

利用挤压技术，通过摩擦、剪切、加热对物料产生高温、高压、高剪切力作用，可有效降解真菌毒素。张鹏飞[19]利用挤压技术，有效降解麸皮中DON，提高挤压机机筒温度、降低麸皮水分含量、降低主机频率及喂料机频率，将麸皮中DON降解率提高为86.13%±0.03%。郑海燕[20]利用挤压膨化技术降解糙米、玉米、花生粕中的AFB1，降解率为39.6%～77.6%。Zheng等[21]通过挤压蒸煮降解花生粕中的AFB1，降解率为77.6%±2.2%。

2.2 辐射辐射主要是利用微波或者射线对被污染物进行照射，利用射线的能量使真菌毒素发生降解，从而实现脱除。辐射分为离子辐射和非离子辐射。在离子辐射(如 X射线、γ射线、紫外线)中，被照的物体处于低温或不发生显著变化时，其分子结构就可能会发生改变，这些分子结构的改变对于暴露于离子辐射下的活有机体是非常有害的[22]。非离子辐射(如无线电、微波、红外线、可见光等)达到一定强度使导致温度升高后，通常会导致分子结构发生变化，但这种变化是对人类无害的。Aziz等[23]通过实验得出辐射对有害真菌的生长和毒素的产生都有明显抑制，他们的实验证明，与对照组相比，γ射线的剂量为4.0 kGy 时可大大减少霉菌(镰孢霉，曲霉)的生长；在6.0 kGy 时对AFB1的降解率为74.3%～76.7%、OTA 51.3%～96.2%、ZEA达到78%。

微波杀菌技术因具有快速、高效、安全和环保，加热时间短、升温速率快、能耗少、微波辅助碱法降解条件温和、操作简单、降解效率高，更具有无化学物质残留，安全性较高等优点。王勇等[24]用微波辅助碱法处理稻米粉中的AFB1，稻米粉中AFB1的降解率为98.5%，AFB1残留量符合国家标准。林耀盛等[25]利用微波辅助酶法脱除米糠中黄曲霉毒素，结果显示脱除率为92.4%。

2.3 电化学电化学方法的特点是不使用有害化学试剂，绿色环保，不会造成二次污染，降解效率高，降解彻底等。孙艳[26]利用辉光放电等离子体技术能够彻底降解苹果汁中的棒曲霉素，降解效果显著(P<0.05)，在5 min内降解率达到96.6%。Fan等[27]通过调节电流和电压，由电解水发生器产生具有不同pH值的碱性电解水(AlEW)，当pH 12.2时，AlEW具有更大的去除AFB1的潜力(Fan S等，201)。

2.4 化学添加剂

2.4.1 氧化法在氧化剂(次氯酸钠、过氧化氢、二氧化氯等)的诱导作用下，真菌毒素被氧化，从而失去毒性。

臭氧具有较高的活性、渗透性，并自发分解为氧气，不产生有毒有害物质，因此被广泛用于研究农产品中黄曲霉毒素的脱除。刁恩杰[28]利用干法和湿法处理臭氧均能有效降解花生中的AFB1。在相同条件下处理30 h时，干法处理可将花生中的AFB1脱除82.8%；湿法处理可将花生中的AFB1脱除89.7%。孙超[29]发现臭氧水降解DON毒素残留效果显著，短时间反应(<10 min)降解率即可达83%。

二氧化氯(ClO2)作为被WHO、FDA 等组织公认安全、无毒的绿色消毒剂，具有氧化性强、杀菌能力好等特点，已经广泛应用于自来水消毒、空气杀菌、水产和禽畜养殖及医疗等领域。常晓娇等[30]研究了不同浓度的ClO2对AFB1、ZEA、DON和FB1的降解作用，结果表明，对AFB1、ZEA和FB1具有很好的降解效率，而对DON无降解效果。孙超[29]通过ClO2对禾谷镰刀菌生长及产毒基因的抑制实验，说明ClO2可有效预防收获后粮食中禾谷镰刀菌生长以及DON毒素的产生。

2.4.2 还原法还原剂与真菌毒素结合改变真菌毒素的分子结构及毒性。常见的还原剂包括亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠等。Young等[31]在80 ℃使用亚硫酸氢钠溶液处理玉米18h后DON降解率达85%，DON分子转化为DON-磺酸盐。Dänicke等[32]使用含水量22%的饱和蒸汽处理添加焦亚硫酸钠的面粉，处理时间15 min，面粉中DON降解率高达95%，在中性和酸性条件下DON性质稳定，在碱性条件下其结构易被破坏。

2.4.3 加碱法氨气法有很多优点，操作简便，少残留，又来源广泛，氨与AFs结合后发生脱羟作用，致使AFs的内酯环发生裂解失去活性或生成新的无毒小分子，从而达到去毒效果。不足之处，操作周期时间长，氨气熏蒸后，影响被测物外观及食用口感。梁俊平[33]在降解花生中AFB1，氨气在浓度7%时，AFB1降解率为83.5%，降解花生粕中AFB1，氨气在浓度10%时，AFB1降解率为100%。

在稀碱(如NaOH、氨水、氢氧化钙等)等作用下，AFB1的内酯环发生断裂，形成香豆素钠盐或铵盐，可以使其毒性消失。DON 分子中环氧基团被打开或者是C-15进行重排形成醛基或内酯。龙杰[34]在浸渍过程中添加稀碱性物质降低高粱麦芽中霉菌，抑制毒素产生。浸渍在稀浓度的NaOH中可减少麦芽中的微生物菌落数量，所有浸渍在0.2% NaOH溶液中的麦芽品种，其霉菌大约会降低3.5 cfu·g-1，同时，某些种类的霉菌数量也会大大下降，甚至检测不到。

2.5 小结化学脱毒虽然非常有效，真菌毒素脱除率很高，但其实施条件较为苛刻，对微量、难分离的毒素脱除效果并不明显，而且这些方法尤其使用有机试剂时，会引入新的污染物，造成二次污染。

3 生物脱毒

生物脱毒是利用微生物在其生长过程中产生的代谢产物或是微生物自身的特性抑制真菌霉素的生长，进而减少了真菌霉素的污染；或者利用生物间的黏附作用降解和去除真菌毒素。

3.1 发酵与降解微生物的发酵产酶对毒素的降解主要是将霉菌毒素转化为低毒或无毒的物质，相对于其他方法，其优点在于特异性强，而且避免了毒素的二次污染。酶法脱毒具有更好的重复性、均一性和操作简单等特点，黄曲霉毒素的生物降解酶主要为氧化还原酶类，该酶主要作用于AFB1的二呋喃环，从而破坏黄曲霉毒素；对赫曲霉毒素，是针对分子内的肽键进行降解得到小分子氨基酸；对玉米赤霉烯酮，水解内酯环生成玉米赤霉烯醇。

Zhou等[35]利用最有效的降解菌株发酵系统的各种组分，并测定去除T-2的能力。表明乳酸乳球菌是去除T-2最有效的降解菌株。雷娇[36]考察不同培养基成分和不同发酵条件对AFB1降解酶的影响。结果当发酵温度为30 ℃时，AFB1降解率达87.5%，初始pH为7.0时AFB1降解率达89.3%，发酵时间与AFB1降解率呈正相关性，培养4 d时降解率达83.5%。

3.2 微生物吸附微生物吸附是指其菌体细胞壁通过非共价键、官能团间的化学键、大分子之间的相互作用力、以及表面张力等与毒素分子结合，形成复合体系。 Taheur等[37]研究结果表明，当在牛奶中培养时，颗粒的微生物聚生体吸附AFB1、ZEA和OTA的吸附率在82%～100%。

3.3 活体菌株 Armando等[38]研究酿酒酵母菌株的有益性质和AFB1结合能力，因为它们能够去除OTA和ZEA。酿酒酵母RC012和RC016显示出最高的OTA去除效率，而RC009和RC012菌株显示出最高的ZEA去除效率。所有测试的酿酒酵母菌株都能够去除OTA和ZEA，并且物理吸附是去除OTA和ZEA的主要机制。植物乳杆菌B7和戊糖乳杆菌X8菌株吸附的主要位点是细胞壁的肽聚糖，吸附AFB1效率分别是82.6%和86.3%，具有作为生物介质用于脱除环境中伏马毒素的潜力[39]。

3.4 小结相对于另外两种降解技术，生物降解具有无二次污染的优势。其条件温和，但成本比较高。目前大多将几个方法相互结合使用，也是目前研究的主流方向，杨彦琼[40]研究以硅铝酸盐化合物为基础，配合酵母细胞提取物，以科学配比制成一种新型复合吸附剂，通过筛选酵母细胞提取物、膨润土、改性膨润土以及不同配比的复合物在相同条件下对AFB1的吸附效果，得到对AFB1吸附效果最佳的改性膨润土与酵母细胞提取物复合物(比例7∶3)，吸附量为18.3 μg·g-1，吸附率为91.9%。