神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）是儿童最常见的颅外实体肿瘤，辅助诊断常用的肿瘤标记物包括血清神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）和尿香草扁桃酸（vanillymandelic acid，VMA）。NSE 由神经元、周围神经内分泌组织和APUD（amine precursor uptake decarboxylation）细胞分泌。研究表明，各期NB 患儿中均发现NSE 升高，且浓度升高的发生率在晚期转移性疾病中更高[1]。VMA是由交感神经组织或肾上腺髓质前体细胞产生过量的去甲肾上腺素转化成的尿中的代谢产物。NB起源于神经细胞前体，可以产生NSE 和VMA。血清NSE 对诊断NB的特异度低于灵敏度（很多其他肿瘤包括淋巴瘤同样升高），尿VMA的特异度则高于灵敏度。所以，NB的诊断标准需结合参考尿VMA。但是，这两项肿瘤标记物在NB危险分层中的灵敏度和特异度鲜见研究。因此，本研究主要比较血清NSE和尿VMA 两项指标与NB 临床病理特征的相关性以及二者在NB的危险分层中的预测价值。

1 材料与方法

1.1 病例资料

选取2011年9月至2019年9月天津医科大学肿瘤医院收治的确诊为NB 患儿155例，其中男性78例，女性77例；年龄4～136个月，中位年龄36个月。年龄0～12个月为24例，＞12个月为131例。治疗开始前留取血清NSE检测的患儿152例，同时检测血清NSE和尿VMA的患儿109例。

纳入标准：1）病理诊断明确；2）按照中国抗癌协会儿童神经母细胞瘤诊疗专家共识诊断及规范化治疗；3）入院时完善NSE或VMA检查。排除标准：1）伴有其他恶性疾病，如慢性淋巴细胞白血病、先天性心脏病等；2）临床资料不完善，不符合本研究需要；3）入院前已接受放化疗或手术的患儿。

1.2 方法

入院时，在正式开始治疗前留取3 mL静脉血，不抗凝，采用电化学发光法检测血清NSE水平，NSE测定试剂盒购自美国罗氏公司。留取24 h尿，采用色谱-分光光度法检测24 h尿VMA水平，VMA分析试剂盒购自天津福莱特尔医疗器械有限公司。正常参考范围：NSE 0～16.3 ng/mL，VMA＜68.6 μmoL/24 h。肿瘤体积采用1/2×长×宽2（cm3）计算（以CT测量为标准）。病理组织切片H&E染色，根据国际NB病理学分类（INPC）、Shimada系统，将病理类型分为节细胞神经瘤（ganglioneuroma，GN）、节细胞神经母细胞瘤（ganglioneuroblastoma，GNB）和NB，见图1。根据年龄、病理类型、MKI指数将患儿分为INPC预后良好型和预后不良型。骨髓和骨转移灶分别经骨髓穿刺和ECT证实，其余转移灶由MRI、CT 或PET-CT 等影像学证实。病理组织FISH染色确定MYCN基因扩增情况。采用COG风险分组将患儿分为低、中、高危组。

分别比较不同临床特征组间患儿的血清NSE 和尿VMA水平，分组包括年龄、性别、肿瘤体积及部位、病理类型、INSS 分期、危险度分组、是否伴有转移及有无影像学定义危险因子（image-defined risk factors，IDRFs）情况。通过ROC曲线比较二者在疾病危险度中的预测价值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0和R 3.5.1软件进行统计学分析。非正态分布的数值用中位数和四分位数间距表示。采用非参数秩和检验比较组间血清NSE和尿VMA水平是否存在差异，两组间比较结果采用Mann-WhitneyU检验。三组及以上采用Kruskal-WallisH检验，两两比较用Bonferroni法校正显著性水平。采用Logistics回归模型分析血清NSE、尿VMA以及两者联合作用对危险度分组的影响。通过绘制ROC曲线，计算曲线下面积AUC值来判断不同模型间的区分度。采用DeLong法计算AUC的95%可信区间。采用约登指数最大法判定最佳截断点，同时计算敏感度与特异度。通过Bootstrap法进行内部验证，判断模型的一致性。指标间的比较采用Z检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血清NSE和尿VMA水平与NB临床特征关系

109例检测尿VMA的患儿，阴性61例，阳性48例，阳性率44.0%。152例检测血清NSE的患儿中，阴性2例，阳性150例，阳性率98.7%。血清NSE水平在不同临床特征和组织学类型的NB患儿中有显著性差异，计算各组血清NSE水平，以中位数和四分位数间距表示（表1）。提示年龄＞12个月、肿瘤体积＞500 cm3、INSS 4期、病理类型为NB、INPC预后不良、MYCN扩增、肿瘤位于腹膜后、伴有转移、肿瘤包绕大血管和COG高危组的患儿血清NSE水平较非以上临床特征组别显著增高（P＜0.05）。

尿VMA水平仅在INSS 4期、伴有转移、肿瘤包绕大血管、病理类型为NB和COG高危组的组别中差异具有统计学意义（P＜0.05）。在不同性别、肿瘤体积和部位之间差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

病理类型：GN组和GNB组（P=0.003）、GN组和NB组（P=0.006）组间两两比较，差异具有统计学意义。INSS 分期：1 期组和3 期组（调整后P＜0.001），1期组和4 期组（调整后P＜0.001），3 期组和4 期组（调整后P=0.007）差异具有统计学意义。COG 危险度分组：低危组和高危组（调整后P＜0.001），中危组和高危组（P＜0.001），低危组和中危组（调整后P=0.003）差异具有统计学意义。IDRFs影像学定义的危险因子：无和跨间室（调整后P=0.003），无和包绕大血管（调整后P＜0.001）差异具有统计学意义。肿瘤位于纵隔和腹膜后（调整后P=0.004）之间的血清NSE 水平差异具有统计学意义。其他组间比较血清NSE水平差异无统计学意义。

尿VMA 水平的组间差异与NSE 一致。病理类型：GN组和NB组（P=0.010）差异无统计学意义。INSS 分期：1 期组和4 期组（调整后P＜0.001），3 期组和4期组（调整后P=0.001）差异无统计学意义。COG危险度分组：低危组和高危组（调整后P＜0.001），中危组和高危组（P=0.044）差异无统计学意义。IDRFs影像学定义的危险因子：无和包绕大血管（调整后P=0.005）之间的尿VMA水平差异具有统计学意义。其他组之间的尿VMA水平差异无统计学意义。

2.2 对比血清NSE 和尿VMA 鉴别高危组患儿的准确性

血清NSE预测模型的AUC显著高于尿VMA，与联合预测模型比较差异无统计学意义（表2，图2）。结合验证图（图3），发现NSE模型的一致性最好，而联合模型的校正和误差修正线与理想线重合程度较NSE模型相比，稍显偏离，VMA模型的偏离最高，说明一致性最差。以上提示，血清NSE模型的区分度与一致性较好，在实际临床应用中，建议使用该指标。各模型列线图见图4～6。

图1 NB的INPC形态学图示

表1 不同临床病理特征患儿的血清NSE和尿VMA水平比较

表2 NSE和VMA单独及联合应用预测高危组患儿的比较

表2 NSE和VMA单独及联合应用预测高危组患儿的比较（续表2）

图2 血清NSE和尿VMA及二者联合预测高危组患儿的ROC曲线

图3 两项指标预测高危组患儿的模型内部验证

图4 NSE模型列线图

图5 VMA模型列线图

图6 NSE+VMA模型列线图

3 讨论

NB是儿童期一种异质性极强的恶性肿瘤。占儿童恶性肿瘤的8%～10%[2]。近年来手术及放化疗等综合治疗的实施改善了患儿预后，但整体生存率偏低，其中高危组患儿预后尤其不良，整体5年生存率低于50%[3]。高通量研究不断揭示造成这种异质性的分子生物学差异，进一步完善了风险分层。然而，这些分析基于原发肿瘤的病理活检，成本高、耗时长，临床上需要一个灵敏便利的方式来辅助诊断并评估病情。血清NSE和尿VMA等肿瘤标记物因其灵敏度和特异度强，易于采集的特点，已逐渐成为辅助诊断和评估NB病情的常规方法。

血清NSE 在多种肿瘤中均有不同程度的升高，如胰岛素瘤、副神经节瘤等神经内分泌肿瘤、精原细胞瘤、肾母细胞瘤、横纹肌肉瘤中也有报道[4]。NSE在NB的各阶段中均有升高，且水平和分期与预后相关。在晚期和广泛的疾病中，血清NSE 升高的概率更大[1]。

自20 世纪70年代以来尿VMA 一直作为生物标志物用于辅助NB 患儿的诊断和随访[5]。然而，尿VMA的参考值受到饮食等诸多因素的影响[6-7]，采集和测定的不规范同样导致结果的不准确。因此，在新修订的国际NB 治疗反应评估标准（international neuroblastoma response criteria，INRC）中，未纳入24 h尿VMA水平的变化[8]。与VMA相比，NSE取自血液，采集更便捷规范，不受饮食影响，且检测方法相对简单，是更好的肿瘤标记物选择。中国2015年修订的儿童神经母细胞瘤诊疗专家共识提出，当骨髓抽吸涂片和活检发现特征性神经母细胞，并且伴有血清NSE 或尿中儿茶酚胺代谢产物升高即可确诊NB[9]。国外研究中仍然应用VMA 辅助NB的诊断和随访。近年多项研究进行肿瘤标记物的比较[10-12]。有报道称尿VMA的阳性率高于血NSE[10-11]。本研究中，152例患儿检测血清NSE，仅2例阴性，阳性率98.7%；109例患儿检测尿VMA，阴性61例，阳性48例，阳性率44.0%。这可能与儿童24 h尿标本不易收集，检测方法及界值选择有关，样本量少也是原因之一。因24 h尿收集困难，有研究[13]发现，检测随机尿VMA/Cr可替代24 h尿VMA。Tohmola等[14]提出采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）检测血清VMA 代替24 h 尿VMA。同时，有研究发现VMA 与神经细胞发育有关。VMA 是儿茶酚胺代谢的终末产物，细胞发育不良会造成儿茶酚胺代谢相关酶的缺乏或功能障碍，这时代谢产物为HVA，因此有研究提出用VMA/HVA判断预后。肿瘤分化差时，VMA/HVA 比值减小，患儿预后较差[15-16]。本研究中，与NB组织学类型的患儿相比，GNB患儿的尿VMA水平更高。

为不断提高儿茶酚胺检测的灵敏度，越来越多新的检测方法和技术可供选择，因为阳性率难以得到保证、波动性大，产生不同程度的漏诊或误诊。而检测方法较为统一的NSE 则不存在这个问题。Cangemi 等[17]研究提示血清NSE水平＞200 ng/mL的4期非MYCN 扩增的患儿具有更差的无事件生存率。Georgantzi等[18]发现血清NSE水平与肿瘤负荷及疾病死亡相关，与原发肿瘤直径呈线性相关，建议使用血清NSE 鉴别死亡风险高的患儿。另一项研究发现，相比GNB，病理组织类型为NB患儿血清NSE阳性率更高[19]。在临床工作中，本研究发现即使在淋巴瘤、肾母细胞瘤也会出现血清NSE 水平升高，但很少会超过100 ng/mL，而在高危组NB 患儿中，血清NSE 超过370 ng/mL 较为常见。在不同危险度分组的患儿中，血清NSE与尿VMA一致，二者在高危组患儿中的水平显著高于非高危组。本研究绘制ROC曲线比较二者AUC并确定其区分高危组与非高危组患儿的界值。血清NSE的AUC明显大于尿VMA，说明在NB患儿中，血清NSE 鉴别出高危组患儿的准确性高于尿VMA。血清NSE 为98.50 ng/mL 时，灵敏度和特异度最高，尿VMA 为62.28 μmoL/24 h 时，灵敏度和特异度最高，前者的灵敏度和特异度均高于后者。联合NSE 和VMA 预测是否为高危组与单独检测NSE 相比，AUC 差异无统计学意义。结合验证图发现NSE预测模型的一致性最好。NSE的检测可以辅助评估病情，尤其是对无法取得病理活检，急需治疗而各项检查尚未回报的患儿，可以及时制定合适的治疗方案。

综上所述，NSE较VMA与NB更多的临床病理特征相关，更能准确鉴别出高危组患儿，本研究认为NSE是比VMA更为灵敏和准确评估病情与判断预后的指标。尿VMA 需要规范化收集与测定，并且可以尝试更多的检测方法。为进一步比较NSE和VMA在NB诊断与治疗中的价值，应扩大样本量，并进行前瞻性研究验证。