李跃中，杨亚冬，唐靓，张文元

（浙江省医学科学院 1.保健食品研究所；2.生物工程研究所，浙江 杭州 310013）

找到合适的生物支架材料是组织工程韧带/肌腱的关键。天然蚕丝丝素纤维具有较强的耐疲劳性能[1-3]，综合力学性能远优于通常的合成纤维，具有与韧带/肌腱相似的力学性能、良好的生物相容性能和加工性能。

纬编针织的网状支架具有充足的力学性能，伸缩性和柔软性良好[4]。具有高孔隙率、多空间、利于细胞的接种及空气交换的特点。本实验纬编针织蚕丝纤维网状支架，进行机械性能测试及其与骨髓间充质干细胞体外共培养评价；并进行皮下埋植实验，观察其组织相容性及力学性能变化，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要器材和试剂

桑蚕丝（Bombyx Mori silk）购于杭州丝绸市场。I型鼠尾胶原（杭州生友生物技术有限公司），纤维连接蛋白（Fibronectin, Sigma），低糖-DMEM（Gibco），胎牛血清（杭州四季青）。扫描电镜（SU8010，日本HITACHI公司），拉力机（QXW300，上海企想检测仪器有限公司），冷冻干燥机（LL3000，丹麦HetoPowerDry公司），二氧化碳（CO2）培养箱（Thermo Electron Corporation,HEPA class 100，美国Merlette公司），倒置相差显微镜（CKX41，日本Olympus公司）。新西兰白兔共7只，3个月龄，雌性，体重约2 kg，实验动物质量合格证号：SCXK（浙）2013-0055号，浙江省实验动物中心提供与饲养。

1.2 兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）提取及纯化

按参照文献[5]先通过密度梯度离心法提取兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs），再通过贴壁培养法纯化BMSCs。

1.3 蚕丝丝素纤维网状支架的制备

按参照文献[6]将蚕丝用0.5%碳酸钠（Na2CO3）溶液煮沸2次，每次30 min，得到脱胶的蚕丝丝素纤维。再将蚕丝丝素纤维单丝200根，逆时针扭合（2捻）成一小束（含蚕丝丝素纤维单丝400根）。按图2A将纤维小束通过纬编针织成长条网状支架（长2.5 cm×宽0.5 cm）。按参照文献[6]清洗干净。取一根网状支架，经喷金后用扫描电镜（scanning electron microscope, SEM）观察其微观形貌。

1.4 蚕丝丝素溶液的制备

将“1.3”项下制备的脱胶蚕丝丝素纤维剪小剪碎，置于三元溶液中（摩尔比CaCl2︰H2O︰C2H5OH=1︰8︰2），80℃，600 r/min，恒温磁力搅拌器搅拌溶解，脱泡，置于透析袋中用去离子水透析3 d，得到蚕丝丝素溶液，经浓缩后配制成2%蚕丝丝素溶液。

1.5 蚕丝网/胶原-丝素海绵复合支架的制备

5 mg/ml浓度的I型鼠尾胶原用0.1 mol/L氢氧化钠（NaOH）中和后，与等体积的2%蚕丝丝素溶液混匀，滴加于“1.3”项下制备的蚕丝网上，低温冰箱过夜，冻干2 d，环氧乙烷消毒。取一根网状支架，SEM观察。

1.6 蚕丝丝素纤维纬编针织网的机械性能检测

取8个长2.5 cm×宽0.5 cm的蚕丝丝素纤维纬编针织网状支架样品（“1.3”项下制备，不含胶原-丝素海绵），参照文献[6]用拉力机进行力学性能测试。将试样固定于拉力机上，拉力至2 N时测试样横截面积及夹具间距长度，再以拉伸速度50 mm/min进行拉力试验，记录最大载荷、拉伸强度及弹性模量等力学指标。

1.7 支架-BMSCs复合物的体外培养

将已消毒的蚕丝网/胶原-丝素海绵支架浸入200 µg/ml的纤维连接蛋白溶液中，4℃静置24 h，常温晾干。将第3代BMSCs（1×107/ml）接种到支架上，37℃、5% CO2培养箱放置2 h，加足培养基体外培养。培养2 d后，戊二醛固定，锇酸固定，梯度乙醇脱水，临界点干燥，喷金，SEM观察。

1.8 蚕丝网皮下埋植实验

3个月龄健康新西兰白兔5只，3%戊巴比妥钠1.1 ml/kg（即33 mg/kg）耳缘静脉注射麻醉，于背中偏下脊柱两侧进行脱毛、消毒、铺巾，无菌条件下，在兔背部中段偏下脊柱两侧各作一个长约2.5 cm的切口，两侧间距4 cm，切开背部皮肤，钝性分离皮下组织，用止血钳沿肌纤维长轴走向轻轻分开脊柱两侧骶棘肌肌纤维成肌袋，每侧各做一个。每个肌袋植入蚕丝网（“1.3”项下制备，已环氧乙烷消毒，长2.5 cm×宽0.5 cm，不含胶原-丝素海绵）一条，即每只兔子植入两条蚕丝网，保持材料纵轴与肌纤维方向一致，缝合肌膜，然后缝合皮肤。青霉素连续注射3 d，每只实验兔50 万单位/d。每只兔单笼饲养，每天观察兔子的饮食、活动、生长、伤口反应及愈合情况。于术后3个月，用戊巴比妥钠过量麻醉方法将5只动物全部处死，按原切口入路，取出植入的蚕丝网，观察大体形状变化及其周围肌肉情况。共有10个试样，其中2个试样连同周围的肌肉组织取出，经固定、包埋后，横截面切片，苏木精-伊红（hematoxylin and eosin stain, HE）染色、马松（Masson）染色观察。另外8个试样剔除附着的肌肉组织，清洗后于湿润条件下按“1.6”项下方法进行力学性能测试。

2 结果

2.1 BMSCs培养及传代

骨髓经密度梯度离心及贴壁培养后获得BMSCs。通过原代、传代培养后，BMSCs生长旺盛，呈长梭形旋涡生长，见图1。

图1 第3代BMSCs呈长梭形旋涡生长（100×）

2.2 蚕丝丝素纤维网状物的SEM观察结果

蚕丝丝素纤维纬编针织网状物的SEM观察到蚕丝网状物有较大的孔隙，伸缩性和柔软性良好，见图2B。蚕丝网状物滴加胶原-丝素溶液并冻干后，成海绵状，见图2C。

2.3 蚕丝网状支架的机械性能测定

未经埋植的蚕丝网状支架的最大载荷、拉伸强度、弹性模量分别为（110.53±14.60）N、（41.88±5.51）MPa、（199.08±26.14）MPa。

2.4 BMSCs在支架上生长的SEM观察情况

复合培养2 d，BMSCs附于蚕丝网充填胶原-丝素海绵支架生长，增殖良好，呈立体生长，图2D。

2.5 蚕丝网皮下埋植实验结果

2.5.1 大体观察 术后动物均存活至实验完成，进食、排泄和活动正常。

2.5.2 组织学观察 蚕丝网埋植3个月后，未见有明显降解。经HE染色、Masson染色，可见支架与周围组织的组织相容性良好，可见有肌肉长入蚕丝网支架，产生胶原，见图3A、图3B。

图3 蚕丝网埋植3个月后的组织学观察（×400）

2.5.3 埋植后蚕丝网的力学性能测试 兔子皮下埋植3个月后，蚕丝网的最大载荷、拉伸强度、弹性模量分别为（74.85±11.36）N、（28.84±4.39）MPa、（130.79±19.87）MPa。

3 讨论

天然蚕丝丝素纤维坚韧无比，强伸性好，具有优良的力学性能[7]能在体内外长期保持其优良的机械性能[8]，能满足韧带/肌腱的强力要求，蚕丝丝素纤维已作为有吸引力的生物材料，且蚕丝丝素具有良好的生物相容性[9]及低免疫原性[10]，有望用于制作组织工程韧带/肌腱[11-12]。由于蚕丝再生丝素是将天然蚕丝丝素纤维溶解、消化后获得的蛋白，有一些化学键已被打断，所以再生丝素更加容易降解。许多研究结果表明，天然蚕丝纤维的降解速率明显慢于再生蚕丝丝素材料（例如再生丝素海绵、膜或多孔材料）[13-15]。胶原-再生蚕丝丝素海绵填充预留细胞生长空间，以适于种子细胞的生长。胶原最先降解，再生蚕丝丝素海绵次之，天然蚕丝丝素纤维最后降解，以实现梯度降解，为肌腱和韧带组织工程支架开发带来新的契机。与传统的韧带/肌腱修复材料相比，基于蚕丝材料的组织工程韧带/肌腱具有原料来源充足、组织相容性好、生物力学性能好、可塑性强及可永久性替换缺损韧带/肌腱等优点，是目前的研究热点[16-17]。因此，丝素蛋白有很大的转化为临床应用的潜力。大量研究证实，BMSCs具有分化为各种间叶质系的潜力，包括成纤维细胞以及骨原性、软骨原性和肌原性细胞的潜力。此外，BMSCs已经有效地应用于骨骼肌、软骨及骨骼组织的修复，尤其在骨骼[18]、肌腱[19]和韧带[20]。

蚕丝丝素纤维纬编针织网支架的空隙被胶原-再生丝素海绵所占据，为细胞提供了一个附着点，而不致于从支架空隙中漏掉。在纤维上吸附蛋白质对于提高细胞的控制和引导是至关重要的。笔者前期实验表明，不经表面修饰的蚕丝网/胶原-丝素海绵支架，细胞容易流失，而经纤维连接蛋白表面修饰后，细胞黏附效果有了较好的改善。本实验于蚕丝网/胶原-丝素海绵支架上BMSCs培养2 d，细胞可在支架上黏附，支持BMSCs生长。

动物肌肉埋植实验是目前国际上通用的评价医用材料对组织毒性刺激的一种重要的体内实验方法。结果表明蚕丝网皮下埋植3个月后，组织相容性良好，并能保持相当强的力学强度。

本实验结果提示，蚕丝网状支架具有良好的力学性能、细胞相容性及组织相容性，皮下埋植3 个月后还具有相当强的力学强度，有望作为组织工程韧带/肌腱的支架材料。