邵 敏， 王 琴， 林 青， 赵紫玉， 陶 亮

(中山大学中山医学院药理学教研室， 广州 510080)

血栓形成可以导致多种疾病，例如心肌梗死、脑血栓、肺血栓、风湿性心脏病以及肾衰竭[1]。其形成机理十分复杂，血液成分、血管壁和血液流动异常与之密切相关。在血液成分中，血小板和各种凝血因子在血栓的形成过程中扮演了极其重要的角色。常用的抗血栓药物可分为：抗凝血药、抗血小板聚集药和溶血栓药[2-3]。临床上常用小剂量阿司匹林预防血栓形成，但存在一些不良反应,如阿司匹林抵抗、胃肠道反应、过敏反应、肝肾损害、水杨酸反应，故其应用具有一定的局限性。因此，预防血栓形成药物的研发显得尤为重要。研究表明雪菊和杭白菊含有黄酮类、氨基酸、糖类、挥发油等多种成分，具有降血压、降血脂、抗肿瘤、抗衰老等多种活性[4-9],但其预防血栓形成的药效未见报道，因此本实验研究雪菊和杭白菊的水提物对凝血功能以及血小板聚集功能的影响，深入挖掘雪菊和杭白菊的药用价值，旨在为新型预防血栓形成的药物的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器雪菊中药饮片购于安徽德昌药业饮片有限公司，产地新疆(批号：20160102)；杭白菊购于药店，产地浙江，生产厂家为康美中药；阿司匹林(A2093-100g)、羧甲基纤维素钠(21904-100G)、二磷酸腺苷(ADP)及凝血酶购自Sigma公司；花生四烯酸(AA)购自上海船夫有限公司；普利生LBY-NJ四通道血小板聚集仪购自北京普利生仪器有限公司；BD血凝管购自美国BD公司；粉碎机购自广州市旭朗设备有限公司；旋转蒸发仪购自上海爱朗仪器有限公司；全自动凝血分析仪购自希森美康株式会社。

1.1.1 雪菊水提物的制备 将干燥的雪菊花序粉碎，取50 g放入2 000 mL烧杯中，往其中加入1 000 mL蒸馏水，煎煮1 h(温度100℃)，滤出药液。然后再向烧杯内加水1 000 mL，重复上述操作，合并2次滤液，置于旋转蒸发仪内浓缩至100 mL，作为原液储存。给药前用蒸馏水配制成500 mg/mL原生药(此处的500 mg/mL是按原生药来算的，也就是最初投入的50 g干燥雪菊花序，最后煎煮蒸发浓缩得到100 mL药液)。

1.1.2 杭白菊水提物的制备 将干燥的杭白菊花序粉碎，取50 g放入2 000 mL烧杯中，往其中加入1 000 mL蒸馏水，煎煮1 h(温度100℃)，滤出药液。然后再向烧杯内加水1 000 mL，重复上述操作，合并2次滤液，置于旋转蒸发仪内浓缩至100 mL，作为原液储存。给药前用蒸馏水配制成500 mg/mL原生药。

1.2动物与分组健康雄性昆明小鼠80只，体质量18～22 g,由南方医科大学实验动物中心提供[SPF级，许可证号SCXK(粤)20160041]。动物随机分为8组：正常对照组(生理盐水)、溶媒组(0.5%CMC-Na)、阿司匹林高剂量组(90 mg/kg)、阿司匹林低剂量组(30 mg/kg)、雪菊水提物高剂量组(XJ 20 g/kg)、雪菊水提物低剂量组(XJ 10 g/kg)、杭白菊水提物高剂量组(HBJ 20 g/kg)、杭白菊水提物低剂量组(HBJ 10 g/kg)，每组10只。健康雄性SD大鼠40只，体质量180～220 g，由南方医科大学实验动物中心提供[SPF级，许可证号SCXK(粤)20160041]。动物随机分为5组：正常对照组(生理盐水)、溶媒组(0.5%CMC-Na)、阿司匹林组(15 mg/kg)、雪菊水提物组(10 g/kg)、杭白菊水提物组(10 g/kg)，每组8只。

1.3凝血时间的测定(毛细玻管法) 健康雄性昆明小鼠按上述方法随机分组后，连续灌胃给药7 d，每天1次，末次给药后1 h，用玻璃毛细管插入小鼠眼内眦球后静脉丛，深约4～5 mm，轻轻转动再缩回。自血液流入管内开始计时，血液注满后取出毛细管平放在实验台上，每隔30 s折断两端毛细管约0.5 cm，并缓慢向左右拉开，观察折断处是否有血凝丝，至血凝丝出现为止，所用时间即为凝血时间。

1.4出血时间的测定(剪尾法) 健康雄性昆明小鼠按上述方法随机分组后，连续灌胃给药7 d，每天1次，末次给药后1 h，用利剪刀在小鼠尾部距尾尖0.5 cm处剪断，立即将尾部浸入37℃,0.9%的生理盐水中，血液流出到停止即为出血时间(至少>30 s)，如果出血时间超过15 min，则出血时间记为15 min。

1.5凝血四项的测定健康雄性SD大鼠按上述方法随机分组后，连续灌胃给药7 d，每天1次。末次给药1 h后，用10%水合氯醛麻醉，给药体积为0.4 mL/100 g，腹主动脉采血，3 000 r/min，15 min离心取上清，获得贫血小板血浆，用全自动凝血分析仪检测凝血四项：PT(凝血酶原时间)、APTT(活化部分凝血活酶时间)、TT(凝血酶时间)、FIB(纤维蛋白原)。

1.6体外血小板聚集率的测定健康雄性SD大鼠经3～5 d适应性饲养后，用10%水合氯醛麻醉(给药体积为0.4 mL/100 g)，腹主动脉采血后800 r/min，10 min，离心取上清，制备富血小板血浆(PRP)，剩余血液3 000 r/min，15 min离心取上清，制备贫血小板血浆(PPP)，用贫血小板血浆稀释富血小板血浆，调节其血小板数目至(300～500)×109/L。取稀释后的富血小板血浆270 μL加入测试杯中，分别加入30 μL的生理盐水，0.5%CMC-Na，阿司匹林(10 mM)，雪菊水提物30 μL，杭白菊水提物30 μL，取300 μL的PPP调零，将加入药物和富血小板血浆的比色杯放入37℃的恒温孔中孵育5 min，分别加入ADP(终浓度为10 μM)，凝血酶(终浓度为20 U/mL)，AA(终浓度为1.5 mM)诱导血小板聚集，测定5 min内的最大血小板聚集率[10]。

1.7体内血小板聚集率的测定健康雄性SD大鼠按上述方法随机分组后，连续灌胃给药7 d，每天1次。末次给药后1 h，用10%水合氯醛麻醉(给药体积为0.4 mL/100 g)，腹主动脉采血，800 r/min，10 min，离心取上清，制备富血小板血浆(PRP)，剩余血液3 000 r/min，15 min离心取上清，制备贫血小板血浆(PPP)，用贫血小板血浆稀释富血小板血浆，调节其血小板数目至(300～500)×109/L。取稀释后的富血小板血浆300 μL，放入37℃恒温孔中孵育5 min，用PPP调零，分别加入ADP(终浓度为10 μM)，AA(终浓度为1.5 mM)诱导血小板聚集，测定5 min内的最大血小板聚集率[11-12]。

1.8统计学处理采用SPSS 22.0及GraphPad Prism 6.0进行统计学分析，采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1凝血时间测定结果与溶媒组相比，阿司匹林高剂量组(90 mg/kg)可以显著延长小鼠的凝血时间(P<0.01)，阿司匹林低剂量组(30 mg/kg)对小鼠的凝血时间无明显变化(P>0.05)；与正常对照组相比，雪菊水提物高剂量组(20 g/kg)可以显著延长小鼠的凝血时间(P<0.01)，雪菊水提物低剂量组(10 g/kg)无明显变化(P>0.05)；与正常对照组相比，杭白菊水提物高低剂量组(20、10 g/kg)均可以显著延长小鼠的凝血时间(P<0.01)，见图1A。

2.2出血时间测定结果与溶媒组相比，阿司匹林高、低剂量组(90、30 mg/kg)均可以显著延长小鼠的出血时间(P<0.01)；与正常对照组相比，雪菊水提物高剂量组(20 g/kg)可以显著延长小鼠的出血时间(P<0.01)，雪菊水提物低剂量组(10 g/kg)无明显变化(P>0.05)；与正常对照组相比，杭白菊水提物高低剂量组(20、10 g/kg)均可以显著延长小鼠的出血时间(P<0.01)，见图1B。

2.3凝血四项测定结果与溶媒组相比，阿司匹林组可以降低FIB(纤维蛋白原)的含量，且具有统计学差异(P<0.05)，而PT、APTT、TT则无明显变化(P>0.05)；与正常对照组相比，雪菊水提物组可以延长TT，且具有统计学差异(P<0.05)，而PT、APTT、FIB则无明显变化(P>0.05)；与正常对照组相比，杭白菊水提物组可以延长APTT, 且具有统计学差异(P<0.05)，而PT，TT，FIB则无明显变化(P>0.05)，见图2。

2.4体外血小板聚集率测定结果在体外实验中，与溶媒组相比，阿司匹林组可以显著降低由ADP、凝血酶、AA诱导的血小板聚集率(P<0.01)；与正常对照组相比，雪菊和杭白菊的水提物均可以降低由ADP、凝血酶、AA诱导的血小板聚集率(P均<0.01)，见图3。

2.5体内血小板聚集率测定结果在体内实验中，与溶媒组相比，阿司匹林组可以显著降低由ADP、AA诱导的血小板聚集率(P<0.01)，且阿司匹林组对AA诱导的血小板聚集更有针对性，抑制效果更好；与正常对照组相比，雪菊水提物组可以显著降低由ADP诱导的血小板聚集率(P<0.01)，对AA诱导的血小板聚集率则无明显变化(P>0.05)；与正常对照组相比，杭白菊水提物组可以显著降低由AA诱导的血小板聚集率(P<0.01)，对ADP诱导的血小板聚集率则无明显变化(P>0.05)，见图4。

3 讨论

小剂量阿司匹林作为临床上预防血栓形成的常规用药，其作用机制为抑制环氧合酶COX1，从而抑制血小板中TXA2的合成，抑制血栓的形成。但是大剂量的阿司匹林对心血管系统的作用一直存在争议。血小板和血管内皮细胞都可以产生COX1，却作用于不同的功能酶。血小板中存在TXA2酶，利用AA生成TXA2。血管内皮细胞中存在PGI2合成酶，利用AA生成PGI2。TXA2和PGI2为一对生理性拮抗剂，前者为最强的缩血管物质，而后者可以舒张血管。小剂量阿司匹林对TXA2的合成影响大，从而产生抗血小板聚集的作用，延长出血时间。因为血小板不能合成新的COX1，但是血管内皮可以合成新的COX1,所以小剂量阿司匹林对PGI2合成影响较小。但是大剂量阿司匹林对二者影响都较大，所以大剂量阿司匹林抗血小板聚集的作用不大。大剂量阿司匹林可以抑制凝血酶原的合成，从而延长凝血时间。

出血时间是指在一定条件下，人为刺破皮肤毛细血管后，从血液自然流出到自然停止所需的时间，反映生理性止血功能，主要用于检查血小板疾病、血管与血小板之间功能的缺陷、某些凝血因子的缺陷。其影响因素主要为血小板的数量和质量、毛细血管结构和功能以及血小板与毛细血管之间相互作用，而受血液凝固因子含量及活性作用对其影响较小。凝血时间是指血液离开血管，在体外发生凝固的时间。原理是离体静脉血与普通玻璃试管接触后，因子Ⅻ和内源性凝血系统被激活，最后生成纤维蛋白而使血液凝固。凝血时间可以反映血液的凝固能力凝血时间用于测定血液的凝固能力，[A17]主要是测定内源性凝血途径中各种凝血因子是否缺乏，功能是否正常，或者是否有抗凝物质增多。其影响因素主要为各种凝血因子的含量。本研究结果显示，雪菊水提物高剂量组(20 g/kg)、杭白菊水提物、高低剂量组(20、10 g/kg)均可以显著延长小鼠的凝血时间和出血时间(P<0.01)。

凝血四项为手术患者必查的一个项目，以便在手术前，了解清楚患者的止血功能是否存在缺陷，为手术中的突发状况作好应急措施。凝血四项包括凝血酶原PT、APTT、TT和FIB。PT主要反映外源性凝血系统的情况，延长表示凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ的缺乏。APTT主要反映内源性凝血系统的情况，延长表示凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的缺乏。TT和FIB则反映凝血共同途径的情况，TT表示纤维蛋白原转化为纤维蛋白的时间，FIB反映纤维蛋白原的含量。本研究结果显示，低剂量阿司匹林可以减低纤维蛋白原的含量，但是并未延长凝血时间。分析其原因可能是纤维蛋白原含量降低的程度还没有达到可以延长凝血时间的程度。雪菊水提物可以延长TT，影响凝血共同途径，杭白菊水提物可以延长APTT，影响内源性凝血途径。

血小板是参与血栓形成的重要细胞，其黏附、释放、聚集与血栓形成密切相关，尤其是聚集。ADP可以与血小板膜上P2Y12受体结合，P2Y12受体与Gi蛋白偶联，抑制血小板腺苷酸环化酶的活性，从而降低血小板中cAMP水平，引起血小板的聚集。凝血酶可以与血小板膜上的PAR1和PAR4受体结合，再耦合于Gq蛋白，使细胞内Ca2+升高，cAMP水平降低，从而引起血小板的聚集。血小板膜上不存在AA受体，AA作用于血小板主要是通过COX1生成TXA2，诱导血小板聚集[13]。本研究结果显示雪菊和杭白菊的水提物在体内体外实验中均可以抗血小板聚集。阿司匹林对AA诱导的血小板聚集具有很强的敏感性。在体外实验中，发现雪菊和杭白菊的水提物对ADP、凝血酶、AA诱导的血小板聚集都有抑制作用，然而在体内实验中发现雪菊的水提物只能抑制ADP诱导的血小板聚集，杭白菊的水提物只能抑制AA诱导的血小板的聚集。综上可以得出：雪菊抗血小板聚集的机制可能是作用于血小板聚集的最终共同途径GPⅡb/Ⅲa，以及抑制ADP受体。杭白菊抗血小板聚集的机制可能是作用于血小板聚集的最终共同途径GPⅡb/Ⅲa，以及抑制AA通路。而造成雪菊水提物和杭白菊水提物体内体外不同抗血小板效应的原因可能为二者经体内代谢后，作用物质发生改变，从而作用位点不同，进而对ADP与AA 诱导的血小板聚集产生不同作用。