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(北京林业大学生物科学与技术学院,食品加工与安全北京市重点实验室,北京 100083)

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa)又名不老莓,属蔷薇科植物,其原产地为北美的东部[1],是一种兼具营养价值与经济效益的独特小型浆果[2]。果实中多酚类成分总含量高达2.5%～3.5%[3],主要包含原花青素、花色苷、类黄酮等,花色苷比例最高可达到1%左右[4]。

近年来，大量研究表明其花色苷提取物具有较强的抗氧化活性,在抗癌、抗炎、降血糖、降血脂、防治心血管疾病等方面有很好的功效[5-10],引起国内外医药和食品界的重视。姚利阳等[11]实验得出黑果花楸花色苷、总黄酮、多糖含量均高于蓝莓和蓝靛果,含量分别为0.352、2.636、1.764 mg/g;Kulling等[12]采用氧自由基吸收能力测定法(ORAC)测得黑果腺肋花楸比蓝莓、黑莓、黑加仑等水果清除自由基的能力强,ORAC值最高可达158.2～160.2 μmol TE/g。目前国外对黑果腺肋花楸果实的研究主要体现在该果实中营养物质组成和鉴定[13]、多酚类物质抗氧化性以及生物活性物质对人体代谢机理的影响[14]等方面;国内对黑果腺肋花楸的研究起步相对较晚,对黑果腺肋花色苷提取及稳定性系统研究较少,国石磊等[15]研究表明,黑果腺肋花楸花色苷应保存在避光、低温、酸性条件下,避免接触氧化剂、还原剂和Cu2+、Al3+、Fe3+等金属离子。因此本文以溶剂种类、乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间为单因素,采用正交法优化黑果腺肋花楸花色苷提取条件,粗提物经AB-8大孔树脂纯化后,冷冻干燥制成粉末,进而测定不同pH、温度、光照、氧化剂和还原剂对花色苷稳定性的影响。本文旨在有效提高黑果腺肋花楸花色苷粗提取得率，为其稳定性研究提供理论支持,为其深加工和开发利用提供科学参考,并对其推广及功能性研究提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑果腺肋花楸 产自吉林延边,-20 ℃冻藏备用;浓盐酸、醋酸钠、柠檬酸、无水乙醇、无水甲醇、氢氧化钠、亚硫酸钠、双氧水 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

JYL-C012九阳料理机 九阳股份有限公司;BSA224S分析天平 SARTORIUS;RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;V5800紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司;HL-2S恒流泵 上海清浦沪西仪器厂;L3660D低速离心机 上海知信试验仪器有限公司;XMTB电热恒温水浴锅 天津市中环实验电炉有限公司;AB-8大孔树脂 上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黑果腺肋花楸花色苷样品的制备 花色苷粗提:取无霉烂、颗粒饱满的黑果腺肋花楸果实,常温解冻至浆果内外完全软化状态,去梗洗净,使用打浆机连续打浆1 min,储藏于4 ℃冰箱,待用。每次准确称取一定的黑果腺肋花楸匀浆,按一定的比例加入酸性提取溶剂,密封后放入水浴锅中在不同温度下浸提一定的时间。抽滤后在50 ℃下旋转蒸发除去乙醇,粗提取液避光保存。

花色苷纯化:参考相关文献[16-17]方法并稍作修改。选用AB-8大孔树脂用无水乙醇浸泡24 h,待完全溶胀后,用去离子水洗至无醇,然后用5% HCl溶液浸泡12 h后，用去离子水洗至中性;最后用5% NaOH溶液浸泡12 h后,用去离子水洗至中性;抽滤吸干树脂表面水分。采用湿法装柱,取16 mm×50 cm的层析柱,装入的树脂为柱体积的2/3,将黑果腺肋花楸花色苷粗提液以1 mL/min流速上柱吸附,吸附完后用5 BV去离子水洗去蛋白质、多糖等杂质;然后用2.2 BV、pH2.0的80%乙醇以2.0 BV/h流速洗脱，并采集洗脱液,蒸发收集液体中的乙醇溶剂,真空冷冻干燥机(冷阱温度-80 ℃)中干燥24 h后最终得到花色苷冻干粉,密封保存于2 mL试管,置于-20 ℃冰箱中,贮藏备用供稳定性及体外抗氧化实验测定。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 溶剂种类对黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影响 分别配制水、1%柠檬酸、60%乙醇、1%柠檬酸+60%乙醇、60%甲醇、1%柠檬酸+60%甲醇六种试剂。以这六种不同的溶剂作为黑果腺肋花楸花色苷提取剂,取待测黑果腺肋花楸匀浆6份,每份2.00 g,在料液比1∶20 g/mL,提取温度25 ℃下浸提60 min,以4000 r/min离心10 min,分别吸取上清液0.50 mL进行吸光度测定。

1.2.2.2 溶剂体积分数对黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影响 根据1.2.2.1结果选择最佳提取溶剂。取待测黑果腺肋花楸匀浆5份,每份2.00 g,按照1∶20 g/mL料液比分别依次加入含有1%柠檬酸的体积分数20%、40%、60%、80%、100%的乙醇,在25 ℃的恒温水浴锅中浸提60 min,以4000 r/min离心10 min,分别吸取上清液0.50 mL进行吸光度测定。

1.2.2.3 提取时间对黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影响 根据1.2.2.1、1.2.2.2结果选择最佳提取溶剂及其体积分数。取待测黑果腺肋花楸匀浆5份,每份2.00 g,在料液比1∶20 g/mL,提取温度25 ℃下分别浸提30、60、90、120、150 min,以4000 r/min离心10 min,分别吸取上清液0.50 mL进行吸光度测定。

1.2.2.4 提取温度对黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影响 根据1.2.2.1、1.2.2.2结果选择最佳提取溶剂根据及其体积分数。取待测黑果腺肋花楸匀浆5份,每份2.00 g,在料液比1∶20 g/mL,提取温度分别为25、35、45、55、65 ℃下浸提60 min,以4000 r/min离心10 min,分别吸取上清液0.50 mL进行吸光度测定。

1.2.2.5 料液比对黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影响 根据1.2.2.1、1.2.2.2结果选择最佳提取溶剂及其体积分数。取待测黑果腺肋花楸匀浆5份,每份2.00 g,按照料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL分别加入含有1%柠檬酸的乙醇,提取温度25 ℃下浸提60 min,以4000 r/min离心10 min,分别吸取上清液0.50 mL进行吸光度测定。

1.2.3 正交实验 根据单因素结果,以花色苷含量为指标，选择乙醇体积分数(A)、料液比(B)、提取温度(C)、提取时间(D)四个单因素进行正交优化实验,采用L9(34)正交表进行四因素三水平正交试验设计,如表1,确定黑果腺肋花楸花色苷的最佳提取工艺参数。

表1 正交实验设计的因素水平表Table 1 Factor level table of orthogonal experimental design

1.2.4 黑果腺肋花楸花色苷含量和色泽保存率的测定

1.2.4.1 黑果腺肋花楸花色苷含量的测定 通过pH示差法[18]测定,移取黑果腺肋花楸提取液0.5 mL,分别加入pH1.0和pH4.5的缓冲溶液10 mL。置于4 ℃冰箱平衡60 min,稳定后用V5800紫外分光光度计分别在520、700 nm处测定花色苷溶液的吸光值,采用公式(1)计算黑果腺肋花楸提取液中花色苷含量。

式(1)

式中:A为吸光度,A=(A520-A700)pH1.0-(A520-A700)pH4.5;M为矢车菊-3-葡糖糖苷分子量,449.2;DF为稀释因子;V为最终提取液体积,mL;ε为矢车菊-3-葡糖糖苷的消光系数,26900;L为光程,1 cm;W为原料质量,mg。

1.2.4.2 黑果腺肋花楸花色苷色泽保存率的计算 参考孙文娟[19]论文方法,采用公式(2)计算黑果腺肋花楸提取液中花色苷色泽保存率。

式(2)

式中:A1,样品处理后吸光度值;A2,样品初始吸光度值。

1.2.5 黑果腺肋花楸花色苷的稳定性测定

1.2.5.1 pH对黑果腺肋花楸花色苷稳定性的影响 参考江澜等[20]的方法,稍作修改。准确量取0.10 mg/mL黑果腺肋花楸花色苷水溶液11份,每份10 mL,用不同浓度氢氧化钠溶液和盐酸溶液配制pH1～11的溶液,使花色苷溶液处于1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,10.0、11.0的环境溶液中,摇匀后室温下避光静置90 min,测定520 nm下的溶液吸光值,对照组为未调节pH的样品溶液。

1.2.5.2 光照对黑果腺肋花楸花色苷稳定性的影响 参考赵慧[21]的方法,稍作修改。准确量取0.1 mg/mL黑果腺肋花楸花色苷水溶液6份并分两组,每份10 mL,用不同浓度氢氧化钠溶液和盐酸溶液配制pH2～4的溶液,使两组置于pH分别为2.0、3.0、4.0的环境溶液中,一组置于自然光照,另一组避光处理。测定周期为5 d,每天定时取样后,测定520 nm下的溶液吸光值。

1.2.5.3 温度对黑果腺肋花楸花色苷稳定性的影响 参考江澜等[20]的方法,稍作修改。准确量取0.1 mg/mL黑果腺肋花楸花色苷水溶液6份,每份15 mL,将其置于4、25、37、55、75、100 ℃下,保鲜膜封口加热3 h,每隔1 h测定,取样时迅速冷却至室温,测定520 nm下的溶液吸光值。

1.2.5.4 氧化剂和还原剂对黑果腺肋花楸花色苷稳定性的影响 参考刘芳芳等[22]的方法,稍作修改。分别配制Na2SO3浓度为0.5%、1%、5%、10%的花色苷水溶液以及H2O2浓度为5、10、20、30 mmol/L的花色苷水溶液,室温避光静置2 h,每隔30 min测定520 nm下的溶液吸光值。

1.3 数据处理

每个结果重复处理3次,实验数据使用Origin 7.5进行整理和作图,并采用SPSS 19.0软件对实验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 黑果腺肋花楸花色苷提取的单因素实验结果

2.1.1 溶剂种类对黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影响 由图1可知,不同提取溶剂对黑果腺肋花楸花色苷提取量影响差异较大。1%柠檬酸+60%乙醇溶剂提取效果最佳,花色苷提取量可达3.85 mg/g;水溶剂提取最差,花色苷含量为2.12 mg/g。醇提效果明显高于水提效果,这与花色苷属于水溶性多酚类物质,在有机醇溶剂中的极性较强有关;酸性溶剂的提取效果比同种非酸性溶剂的提取效果好,这是因为花色苷在弱酸性环境中稳定,在中性及碱性下不稳定,结构易被破坏有关。因此选择含1%柠檬酸的60%乙醇溶液作为本试验的提取溶剂。

图1 溶剂种类对黑果腺肋花楸花色苷提取量的影响Fig.1 Effects of solvent type on anthocyanin extraction from Aronia melanocarpa注:1:水;2:1%柠檬酸;3:60%乙醇; 4:1%柠檬酸+60%乙醇;5:60%甲醇,6:1%柠檬酸+60%甲醇。

2.1.2 溶剂体积分数对黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影响 由图2可知,当乙醇体积分数小于60%时,花色苷提取量与乙醇体积分数成正比;乙醇体积分数为60%时,花色苷提取量最高为3.62 mg/g,乙醇体积分数大于60%时,花色苷的提取得率逐渐降低。此趋势的原因可能与花色苷溶液与60%乙醇的极性更相近有关;在乙醇体积分数较低的溶液体系中,由于花色苷的有效溶出率受水溶性较好的物质影响很大,从而导致提取效果较差[25];但在乙醇体积分数过高的溶液体系中,随着脂溶性物质的不断溶出,花色苷溶解度也随之下降,造成提取效果变差。

图2 乙醇体积分数对黑果腺肋花楸花色苷提取量的影响Fig.2 Effects of ethanol volume on anthocyanin extration from Aronia melanocarpa

2.1.3 提取时间对黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影响 由图3可知,随着提取时间的增加,黑果腺肋花楸花色苷的提取含量呈现先升后降的趋势,在提取时间为60 min时达到顶峰,此时花色苷的提取量为3.65 mg/g。呈现此变化的原因可能是随着时间的增加,花色苷逐渐溶出,导致提取量增加;而随着提取时间的持续延长,花色苷被充分提取,同时提取温度过高,花色苷稳定性较低,导致被氧化，从而使其含量降低[26]。

图3 提取时间对黑果腺肋花楸花色苷提取量的影响Fig.3 Effects of extraction time on anthocyanin extraction from Aronia melanocarpa

2.1.4 提取温度对黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影响 由图4可知,一定范围的温度升高,花色苷提取量增加,55 ℃时达到最大值,其提取量为4.28 mg/g;温度继续上升,花色苷的提取量急剧下降。由此可见,黑果腺肋花楸花色苷的热稳定性很差,提取温度过高会破坏C位结构,导致花色苷被降解,影响提取效果[27]。

图4 提取温度对黑果腺肋花楸花色苷提取量的影响Fig.4 Effects of extraction temperature on anthocyanin extraction from Aronia melanocarpa

2.1.5 料液比对黑果腺肋花楸花色苷提取效果的影响 由图5可知,当料液比从1∶15～1∶20 g/mL时,花色苷提取量逐渐上升;当料液比为1∶20 g/mL时达到最大,花色苷提取量为3.71 mg/g;但当料液比大于1∶20 g/mL时,花色苷的含量开始下降。呈现这种先上升后下降的趋势的原因可能是当料液比较小时,花色苷在溶液中达到过饱和状态,但当料液比接近1∶20 g/mL时,原来过饱和状态下的花色苷溶液全部溶解于溶剂中;当料液比超过1∶20 g/mL后,由于此时花色苷分子间的作用力减弱,稳定性降低容易被分解,导致总花色苷得率下降[19]。

图5 料液比对黑果腺肋花楸花色苷提取量的影响Fig.5 Effects of solid-liquid ratio on anthocyanin extraction from Aronia melanocarpa

2.2 黑果腺肋花楸花色苷提取的正交实验结果

黑果腺肋花楸花色苷提取正交试验结果如表2所示,方差分析结果如表3所示。以花色苷提取量为检测指标。

表2 苷正交试验结果Table 2 The results of orthogonal test

表3 正交试验方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test

由R值分析可知,影响黑果腺肋花楸花色苷提取率的各因素主次顺序为提取温度>乙醇体积分数>料液比>提取时间,所以适当地升高温度可以促进黑果腺肋花楸花色苷溶出,但温度过高会对花色苷的结构甚至活性等都造成很大破坏。由k1、k2、k3值可以确定出溶剂浸提提取黑果腺肋花楸花色苷的最佳方案为A1B3C2D2:乙醇体积分数50%,液料比25∶1 g/mL,提取温度55 ℃,提取时间60 min,通过验证试验,按上述优选工艺平行提取3次,求得花色苷含量为(4.32±0.18) mg/g,与正交表格中A1B2C2D2花色苷提取量4.22 mg/g进行比较,表明试验所确定的A1B3C2D2为较优工艺。根据方差分析表,FC>FA>FB>FD,由此可知提取温度对花色苷提取效果的影响高于乙醇体积分数、料液比和提取时间,由FC>F0.05,提取温度对花色苷提取的效果影响显著。

2.3 黑果腺肋花楸花色苷的稳定性测定结果

2.3.1 pH对黑果腺肋花楸花色苷稳定性的影响 由表4可知,黑果腺肋花楸花色苷稳定性受pH影响很大,其原因是不同的pH会使花色苷化学结构发生转变。当pH≤3.0时,果汁颜色几乎为红色,其原因为在酸性环境下黑果腺肋花楸花色苷主要以红色吡喃阳离子结构存在;当pH接近7.0时,果汁颜色呈现淡黄,这是因为在中性环境中主要是存在的形式为无色查尔酮;当pH大于7.0之后,溶液逐渐形成深黄色,这是因为在碱性环境下,花色苷的主要存在形式是蓝绿色醌示结构[19]。由此可知,当pH为1.0时,黑果腺肋花楸花色苷溶液吸光值最高,呈现亮红色,pH≥4.0时溶液颜色逐渐失去红色,因此pH≤3.0时,黑果腺肋花楸花色苷呈红色且稳定性较强,利于保存。

表4 pH对黑果腺肋花楸花色苷稳定性的影响 Table 4 Effects of pH on stability of anthocyanin from Aronia melanocarpa

2.3.2 光照对黑果腺肋花楸花色苷稳定性的影响 由图6可知,不同pH黑果腺肋花楸花色苷水溶液在光照和避光条件下稳定性差异明显。避光保存5 d后pH2.0花色苷水溶液吸光度值从0.895下降到0.809,说明在避光条件下,酸性环境使得花色苷稳定性较好,随着pH的升高,吸光度明显下降,说明色素逐渐开始降解褪色;第3 d,pH4.0和对照组的花色苷水溶液均出现白色絮状沉淀物。光照处理5 d后pH2.0花色苷水溶液吸光度值从0.895下降到0.488,吸光度值急剧下降,说明光照对花色苷的稳定性破坏较强;第3 d开始,光照组所有样品开始出现白色絮状沉淀物。不同pH黑果腺肋花楸花色苷水溶液的吸光值在光照条件下均比避光条件小,避光褪色慢,光照褪色快。可能是因为花色苷在光照条件下酰基脱落,导致稳定性下降。综上所述,避光环境比光照环境更利于花色苷水溶液的稳定性;酸性环境pH2.0相对其他pH条件更利于花色苷水溶液结构保持稳定。

图6 光照对黑果腺肋花楸花色苷稳定性的影响Fig.6 Effects of light on stability of anthocyanin from Aronia melanocarpa

2.3.3 温度对黑果腺肋花楸花色苷稳定性的影响 由图7可知,加热温度和时间对花色苷水溶液的稳定性影响较大。加热温度和时间升高都会导致花色苷水溶液的吸光度值降低,颜色变浅,色泽保存率减小。加热3 h后,在75 ℃时,温度的增加对花色苷稳定性影响较弱,吸光度值从0.208下降到0.153;色泽保存率从100%下降到73.6%;100 ℃时,吸光度值下降到0.074,色泽保存率下降到35.6%。由此可见,黑果腺肋花楸花色苷在75 ℃以内,具有较强的热稳定性,随着温度的升高,其耐热性逐渐降低,这可能是在高温条件下花色苷易氧化褪色[28]。

图7 温度对黑果腺肋花楸花色苷色泽保存率的影响Fig.7 Effects of temperature on color stability of anthocyanin from Aronia melanocarpa

2.3.4 氧化剂和还原剂对黑果腺肋花楸花色苷稳定性的影响 由图8可知,在本文所选H2O2浓度范围内,添加4种不同浓度H2O2后,黑果腺肋花楸花色苷溶液吸光度值呈不同程度的下降趋势。添加H2O2后花色苷溶液吸光度值从一开始就明显低于CK组,随着H2O2浓度不断增大,花色苷吸光度值快速下降,当其浓度达到5%之后,花色苷的吸光度值趋于稳定;随着时间增加,不同浓度的H2O2花色苷溶液吸光度值总体呈现逐渐降低的趋势;色泽方面,H2O2浓度越大,花色苷溶液越接近无色,说明花色苷的破坏很严重。其原因可能是H2O2是亲核性质,花色苷的C位比较容易受到攻击,导致吡喃还阳离子被破坏,生成无色查尔酮物质，继续降解成各种无色脂类以及香豆素衍生物[29],或者相互作用发生聚合形成沉淀。

图8 氧化剂对黑果腺肋花楸花色苷稳定性的影响Fig.8 Effects of the oxidant on stability of anthocyanin from Aronia melanocarpa

由图9可知,在本文所选Na2SO3浓度范围内,添加4种不同浓度Na2SO3后，黑果腺肋花楸花色苷溶液吸光度值均呈不同程度的急剧下降趋势,且Na2SO3浓度越大,吸光度值下降越多。不同于氧化剂对花色苷的影响,花色苷溶液的吸光值随着反应时间的增加趋于平缓,但色泽逐渐变浅。说明黑果腺肋花楸花色苷的稳定性受还原剂Na2SO3的影响也很大,且是一个快速反应的过程,Na2SO3的浓度越大,花色苷的降解率就越快。其原因可能是花色苷溶液属于酸性溶液,在酸性环境下,亚硫酸根会形成亚硫酸氢根,进而亲核攻击花色苷C位[30],形成无色的花色苷烟硫酸盐复合物,导致颜色变浅;还有可能是Na2SO3具有漂白作用,导致溶液颜色变浅。

图9 还原剂对黑果腺肋花楸花色苷稳定性的影响Fig.9 Effects of the deoxidizer on stability of anthocyanin from Aronia melanocarpa

3 结论

采用正交法对黑果腺肋花楸花色苷的提取条件进行优化,最佳提取条件为:乙醇体积分数50%、液料比25∶1 g/mL、提取温度55 ℃、提取时间60 min,此条件下黑果腺肋花楸花色苷提取量可达到(4.32±0.18) mg/g。通过实验表明,当pH为1.0时,黑果腺肋花楸花色苷溶液吸光值最高,呈现亮红色,pH≥4.0时溶液颜色逐渐失去红色,因此黑果腺肋花楸花色苷应在酸性条件下比较稳定。

黑果腺肋花楸花色苷溶液吸光值随着温度的升高和光照时间的增加逐渐变小,避光环境比光照环境更利于花色苷水溶液保存;加工热处理温度应保持在75 ℃内,储藏时应存放于4 ℃冰箱。氧化剂H2O2和还原剂Na2SO3对黑果腺肋花楸花色苷溶液均会造成不同程度的破坏,在加工运输保存时应尽量避免接触此类氧化剂和还原剂。

在后续的研究中,拟采用多种方法对比提取黑果腺肋花楸花色苷;在稳定性方面拟采用多种方法提升花色苷的稳定性,如化学方法修饰花色苷结构或采用蛋白包埋花色苷的方式提升花色苷的稳定性。