,明达, , ,成辉,,

(1.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030; 2.山东禹王生态食业有限公司,山东禹城 253000)

酱油是由大豆或豆粕等蛋白质原料和面粉、小麦粉等淀粉质原料,在曲霉等微生物产生的蛋白酶和淀粉酶等酶系作用下,经过细菌、酵母菌等微生物的长期发酵,形成的富有多种氨基酸和糖类的色香味俱佳的调味品[1]。香气是酱油风味的重要品质特征,目前国内外对酱油的挥发性香气成分的检测手段已经十分成熟,熊芳媛等[2]通过用乙醚提取酱油香气成分,气相色谱-质谱联用分离鉴定其化学组成;王林祥等[3]采用同时蒸馏萃取法提取某高盐稀态酱油的挥发性成分,用GC/MS分析香气成分,共鉴定出种52种化合物;还可以通过电子鼻对气味进行追踪,但其识别精度不高。

顶空固相微萃取(HS-SPME)是一种集萃取、浓缩样品中挥发性香气成分的技术,具有操作简便、快速,无需溶剂等优点,已广泛应用于诸如酒类、豆瓣酱和豆豉等发酵产品的挥发性香气成分的检测。目前通过顶空固相微萃取的方法分析酱油中的香气成分的研究较为普遍:Meng等[4]在日式酱油中首次运用顶空固相微萃取鉴别出3种挥发性硫醇——糠基硫醇(咖啡香)、苄基硫醇(烟熏焦臭味)和2-巯基丙酸乙酯(热带果香)并证明这三种物质是热杀菌酱油中的典型香气物质。张艳芳等[5]利用固相微萃取的方法从低盐固态发酵酱油中分析鉴定出55 种挥发性风味成分,结果发现4-乙基愈创木酚低盐固态酱油特有的重要香气成分;Sun等[6]采用SPME-GC-MS技术对12种高盐稀态法发酵的商业酱油中80种挥发性风味物质进行分析,发现其共有香气组分有34种,而主要香气成分是醇类和酸类;张海珍等[7]人研究发现高盐稀态发酵酱油中含有76种香气组分,而低盐固态发酵酱油中含有62种香气组分。综上,可以发现低盐固态发酵酱油由于发酵周期短,其香气组分明显少于高盐稀态发酵的酱油。而基于酱油质量和产率的考虑,工厂中通常在低盐固态发酵的基础上适当提高盐含量,避免了较长的发酵周期,能够明显提高酿造酱油的风味,但对这种酿造工艺的研究未有报道。

本研究是通过运用顶空固相微萃取的方法对不同发酵时间段的酱油香气成分进行分析,以期对酱油的香气形成进行探究,并为提升传统酱油的品质提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酱油样品 取自珍选公司。

2010-plus气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司;手动进样器、固相微萃取头(75 μm CAR/PDMS) Supelco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酱油的发酵工艺流程图

图1 酱油发酵工艺流程图Fig.1 Soy sauce fermentation process

1.2.2 酱油样品的采样 从黑龙江省珍选公司发酵车间分别取发酵第5、10、20、30、42、50、59 d的酱油进行采样,每个样品(大约200 mL)封装在不透明的塑料瓶中,并立即保存于-4 ℃冰箱中,以备分析。

1.2.3 萃取条件 参考邓岳等[8]的方法,吸取酱油5 mL放入15 mL顶空进样瓶中,加入磁力搅拌子,放在40 ℃水浴锅中保持20 min,磁力搅拌速度200 r/min。用75 μm CAR/PDMS固相微萃取头的手动进样器对酱油样品萃取,萃取温度40 ℃,顶空吸附40 min。

1.2.4 挥发性物质的GC-MS测定 采用TR-5ms弹性石英毛细色谱分析柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),载气为高纯氦气(1.0 mL/min),采用电子轰击电离(EI)离子源,电子能量70 eV,电子倍增器电压350 V,离子扫描范围33～350 m/z,扫描速度3.00 scans/s,离子源温度250 ℃,传输线温度250 ℃。程序升温条件(液体进样):起始温度60 ℃,保持2 min,以10 ℃/min 升至90 ℃,保持2 min,再以5 ℃/min升至130 ℃,保持2 min,再以10 ℃/min升至230 ℃,保持3 min。进样量5 μL,不分流[9]。

通过计算机检索,同时利用NIST 08和WILEY 09谱库相互匹配进行定性分析。各组分相对含量按照峰面积归一化法计算。

1.2.5 香气活性值(OAVs) 香气活性值(odor active values,OAVs)用于表征香气成分的贡献度[10],计算公式如下:

式中,A:某挥发性成分的质量浓度,μg/L;B:该挥发性成分的阈值,μg/L。

1.2.6 主成分分析 选取样品中香气活性值大于1的挥发性香气成分作为主要成分,进行主成分分析。从这些主要呈香物质中提取出两个主要成分,其累计贡献率为100%,完全能代表呈香物质的绝大部分信息[11]。

1.3 数据处理

每个样品重复检测三次,检测结果取平均值±标准差,采用SPSS 20.0 软件的Duncan 多重检验及主成分分析进行数据处理及分析[12],图表制作采用Origin 8.5软件。

2 结果与分析

2.1 酱油HS-SPME气相色谱-质谱总离子流色谱图

通过运用顶空固相微萃取的方法对发酵时间分别为第5、10、20、30、42、50、59 d的酱油样品进行测定,测定结果如图2所示,可以看出酱油中的挥发性香气物质得到了很好的分离。总挥发性物质相对含量见表1，在整个发酵过程中,共统计了31种风味化合物,其中包括醇类3种,酸类4种,醛类4种,酯类6种,酚类4种,呋喃3种,其他化合物7种。醇类物质为:1-辛烯-3-醇、苯乙醇、1,5-甲基-2-(1-甲基乙基)环己醇;酸类物质为:乙酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、2-甲基丙酸;醛类主要成分为:苯乙醛、壬醛、苯甲醛;酯类的主要成分为:1,2-苯二甲酸二异丁酯、苯乙酸乙酯;酚类为4-乙烯基愈创木酚、愈创木酚。

图2 酱油HS-SPME气相色谱-质谱总离子流图Fig.2 Total ion flow diagram of soy sauce HS-SPME gas chromatography-mass spectrometry

表1 总挥发性物质的相对含量Table 1 Relative content of total volatile substances

通过对顶空固相微萃取所得到的香气成分的含量和香气活性值进行分类整理(表1)可以发现:在酱油发酵过程中,除了醛类、酚类、酯类在发酵42 d后种类稍有减少,其他各类化合物种类总体保持增长的趋势。在发酵前期,各类化合物的含量均呈现升高趋势,到第42 d时,醇类、酯类、酚类的含量达到最大值,而在发酵后期,醇类、酸类、醛类、酚类则表现出下降的趋势,这可能是由于部分物质性质活泼,与其他物质结合生成新组分;呋喃类和其他类则保持持续增长。

香气活性值是用于表征酱油重要呈味物质的一个重要指标。通常认为OAVs 大于1 的化合物对酱油的风味有贡献。由表1可知,香气活性值>1的化合物共有4种,包括1-辛烯-3-醇,苯乙醛,乙酸,4-乙烯基愈创木酚,香气活性值<1的化合物有8种,对香气的形成也有一定的贡献。

酱油中的醇类物质主要是由糖和氨基酸的微生物发酵代谢产生的,实验中检测到的主要的醇类化合物包括1-辛烯-3-醇、苯乙醇、5-甲基-2-(1-甲基乙基)环己醇,其他的醇类化合物由于匹配值<80%而被忽略。在这三种化合物中,1-辛烯-3-醇和苯乙醇含量较高,并且1-辛烯-3-醇的平均香气活性值达到4.6。1-辛烯-3-醇是米曲霉孢子的特征性挥发性成分,带有一种蘑菇的香气[16],而酱油的发酵过程中采用了米曲霉作为主要的发酵菌种,可以推测 1-辛烯-3-醇可能主要来源于大曲发酵阶段。苯乙醇具有玫瑰的香气,是酵母菌乙醇发酵降解苯丙氨酸的产物[17],在本次实验中并未检测到乙醇,原因可能是大部分的乙醇均被降解为苯乙醇[18]。

酱油中检测到的酸类物质有4种,分别为乙酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、2-甲基丙酸,在酱油生产过程中,乙酸是全部样品中均检出的物质,主要是由乳酸菌等繁衍代谢产生的,平均香气活性值为2,对酱油香气的贡献很大,在很多发酵工艺中会通过添加酵母菌改善酱油风味[19-20]。而2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、2-甲基丙酸均具有“奶酪香”的香气特征。

酱油中醛、酮类物质一般具有令人愉悦的香味,如甜香、草香、果香、焦香等,因此被认为是可以提高食品风味质量的物质。酱油中检出的化合物以苯乙醛、壬醛、苯甲醛为主,且在所有酱油中均有检出。苯乙醛的平均香气活性值是1.5,具有浓郁的玉簪花香气,是酿造酱油中的特征组分。这3个醛类能够由氨基酸降解产生,因此其产生可能与发酵过程蛋白质代谢有关系[21]。

酱油中酯类化合物是已报道物质中品种最多的。大部分酯类物质来源于发酵过程中醇与脂肪酸的酯化反应,在本次试验中酯类化合物仅检出6种——苯乙酸乙酯、软脂酸乙酯、邻苯二甲酸异丁酯、1,2-苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸异丁酯、2-甲基-丙酸 1-叔丁基-2-甲基-1,3-丙烷二基酯,这些组分是发酵过程的耐盐酵母的主要代谢产物,赋予其悦人的“水果香”、“酯香”等[22]。

酚类和吡嗪类化合物是发酵豆制品中非常重要的化合物。本研究检测出的4种酚类物质都是酱油中常见的风味化合物,能贡献烟熏香气,其中4-乙烯基愈创木酚在所有样品中均检出,并且含量相对较高,平均香气活性值达到3.4。这些酚类物质常被认为与木质素的代谢有关,有研究表明增加原料中小麦粉的比例能够提高该类物质的含量[23]。在很多研究中酚类物质被认为是酱油酱香味的主要来源,虽然它们的含量不高,但是由于阈值较低,所以它们具有相对较高的气味活度值,因此对于酱油浓郁的酱香味等风格特征具有决定性的作用[24],而吡嗪类化合物因为匹配度小于80%,未在本次实验中未检出。

呋喃化合物仅检出3种,分别为3-苯基-呋喃、2-乙烯基-苯并呋喃2,5-二甲基-呋喃。然而曾经被报道的重要呋喃类化合物如4-羟基-2-乙基-5-甲基-3-呋喃酮(HEMF)和4-羟基-2,5-二甲基-3-呋喃酮(HDMF)并未在此次实验中检测出,这可能与分析方法采用SPME有关系[25]。其他类物质较多,但其气味阈值尚未找到,其对香气的贡献度还有待研究。

2.2 重要香气成分的主成分分析

对4种主要的香气成分1-辛烯-3-醇,苯乙醛,乙酸,4-乙烯基愈创木酚进行主成分分析,得到了图3中的主成分分析的得分图和载荷图。主成分1和主成分2的贡献百分比为分别为57.824%和26.977%,根据得分图,可以将不同发酵时间段的酱油样品分为3簇,第一簇为第5、10、20 d的样品,第二簇为第30 d的样品,第三簇为第42、50、59 d的样品。发酵前20 d,香气成分缓慢积累,到第30 d时,出现较大的增长,而到发酵第42 d时,香气成分的种类和含量都几乎达到最大值,与发酵第50 d、第59 d的差别不大。根据载荷图,对4种主要的香气成分1-辛烯-3-醇,苯乙醛,乙酸,4-乙烯基愈创木酚进行主成分分析,从这4种主要呈香物质中提取出两个主要成分,其累计贡献率为84.801%,能代表呈香物质的绝大部分信息,发酵时间为 5、10、20、30 d的点落在第1象限,主要以具蘑菇香风味的1-辛烯-3-醇,乙酸及4-乙烯基愈创木酚为特征;发酵时间为 42、50、59 d的点落在第2 象限,与具玉簪花香气的苯乙醛相对应。综上,发酵时间为5～42 d时,主要以1-辛烯-3-醇,乙酸及4-乙烯基愈创木酚为特征组分,而发酵时间为42～59 d时,主要以苯乙醛为特征组分。

图3 主成分分析的得分图(A)和载荷图(B)Fig.3 Score map(A)and load map(b)of the principal component analysis

3 结论

通过运用顶空固相微萃取联合气质的方法测定了珍选酱油酿造过程中多种挥发性香气成分,研究发现:这个发酵过程中共检测出31种挥发性的香气化合物,包括醇类3种,醛类4种,酸类4种,酯类6种,酚类4种,呋喃3种,其他化合物7种。醛类、酚类、酯类的种类和含量在发酵过程中呈现出先增大后减小的趋势,在发酵第42 d达到最大值,其他各类化合物种类则总体保持增长的趋势。通过测定其香气活性值,确定了珍选酱油中主要的香气物质为1-辛烯-3-醇、苯乙醛、乙酸、4-乙烯基愈创木酚;在主成分分析中,发酵时间为5～42 d时,主要以1-辛烯-3-醇,乙酸及4-乙烯基愈创木酚为特征组分,而发酵时间为42～59 d时,主要以苯乙醛为特征组分。本文通过对珍选酱油酿造过程中挥发性香气成分进行分析,不仅揭示了香气成分的形成与发酵时间的关系,而且为快速提升传统酱油的品质提供理论依据,具有实践意义。