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(1.中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003; 2.山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心,山东青岛 266002)

近年来,食品安全问题已成为人们普遍关心的问题[1],其中食物过敏问题也越来越受到人们的重视[2]。世界卫生组织(WTO)和联合国粮农组织(FAO)已将过敏疾病认定为当今世界性的重大问题之一[3-4]。调查显示,一些西方国家2.5%的成年人和6%～8%的儿童会有过敏疾病[5]。在中国,约有6%的人群患有过敏疾病[6]。特别在中国沿海地区,海产品的消费量很大,因食用海产品而过敏的消费者逐年增加,以及过敏的长期性和严重性,使得海产品过敏成为重要的公共健康问题[7]。虾与蟹等甲壳类动物及其制品是引起食物过敏较常见的一类食品[8],且多数为终生过敏[9]。虾类过敏反应严重影响着过敏人群的身体健康和生活质量[10],极微量的过敏原就能导致严重的过敏反应[11]。

南美白对虾作为海虾淡养的优良品种[12],其养殖在我国各地得以迅速推广[13],因此有必要对南美白对虾的过敏原进行检测分析。目前,已有许多关于南美白对虾过敏原检测相关研究。García-Orozco等[14]对南美白对虾的一种过敏原精氨酸激酶的分子特性进行了研究。吴海明[15]对南美白对虾过敏原进行了鉴定并用酶法消减。这些方法为过敏原的检测提供了一定技术支持。但是,随着水产品市场需求不断扩大,亟需开发一种高通量、灵敏准确且操作简便的水产品过敏原检测方法。

高效液相色谱作为一种新的液相色谱技术,相对于常规液相色谱而言,有更好的分离效率、峰容量以及灵敏度[16]。这一技术与能够测定化合物的精确质量并与具有MS/MS功能的飞行时间质谱(time-of-flight mass spectrometer,TOF-MS)联用,成为复杂体系分离分析以及化合物结构鉴定的良好平台[17],在水产品过敏原鉴定方面具有很大的潜力。三重四级杆质谱以其高灵敏、精确度和重现性[18],在分析检测中起到了重要作用。因此,本研究采用高效液相色谱-飞行时间质谱检测南美白对虾的过敏原,并初步建立了三重四级杆多反应检测模式快速检测表征过敏原肽段的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南美白对虾 市售;测序级胰蛋白酶(18523 U/mg) 美国Promega公司;甲酸(质谱级) 美国Sigma公司;乙腈 美国Fisher公司;碘代乙酰胺 美国Sigma公司;Folin-酚乙液 北京索莱宝科技有限公司;二硫苏糖醇、尿素、碳酸氢铵、碳酸钠、氢氧化钠、酒石酸钾钠、五水硫酸铜、牛血清蛋白 国药集团化学试剂有限公司。

Nexera X2 30A高效液相色谱仪 日本岛津公司;1290高效液相色谱 美国Agilent 公司;AB SCIEX Triple TOF® 5600质谱仪 美国SCIEX公司;Triple QuadTM 5500三重四级杆质谱仪 美国SCIEX公司;MQS50001型超纯水系统 美国Millipore公司;AB135-S型精密电子分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司;A11分析研磨机 德国IKA公司;CR21G II高速冷冻离心机 日本CHTACHI公司;UFC501008超滤管 美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 南美白对虾蛋白的提取 取六个体形完整的南美白对虾,肌肉用液氮研磨成粉末。取1 g虾粉,用10 mL蛋白提取液(8 mol/L尿素,50 mmol/L NH4HCO3),垂直振荡30 min,高速低温离心20 min(4 ℃,15000 r/min),取上清液,测其蛋白含量,实验平行三次。

1.2.2 提取液蛋白含量的测定 采用Folin-酚法[19]。

1.2.2.1 溶液的配制 Folin-酚甲液由A液和B液5∶1混合而成,临用时现配(A液:10 g碳酸氢钠,2 g氢氧化钠,0.25 g酒石酸钾钠溶于500 mL蒸馏水;B液:0.25 g五水硫酸铜溶于100 mL蒸馏水水中),乙液为商品化试剂。

1.2.2.2 标准曲线的制作 取6支试管,分别加入0、200、400、600、800、1000 μL mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液,用蒸馏水补足到1 mL。每管加入Folin-酚甲液5 mL,摇匀,于25 ℃静置10 min。每管加入Folin-酚乙液0.5 mL,迅速摇匀,30 ℃静置30 min,以蒸馏水为空白,在650 nm处比色测吸光值,实验重复三次。

1.2.2.3 南美白对虾蛋白含量的测定 为了准确测定南美白对虾提取液的蛋白含量,必须使吸光度在线性范围内,因此取1.2.1中的上清原液以及10～1000倍梯度稀释的样品,取样量为1 mL,每管加入Folin-酚甲液5 mL,摇匀,于25 ℃静置10 min。每管加入Folin-酚乙液0.5 mL,迅速摇匀,30 ℃静置30 min,以蒸馏水为空白,在650 nm处比色测吸光值,实验重复三次。

1.2.3 蛋白提取液胰蛋白酶酶解 参考Wisniewski等[20]和Mi等[21]的方法,取1.2.1制得的上清液100 μL,分别加入2 μL 1 mol/L二硫基苏糖醇在60 ℃反应1 h,实验重复三次。取5 μL 1 mol/L现配的碘代乙酰胺,加入到已经冷却至室温的上述反应液中,室温避光反应1 h。采用10K超滤离心管在15000 r/min离心超滤20 min后,每次用200 μL 50 mmol/L碳酸氢铵溶液洗涤膜上层蛋白,共洗涤三次。最后在膜上层加入200 μL 50 mmol/L碳酸氢铵溶液作为缓冲液,并按酶和底物比1∶50,将胰蛋白酶溶液加入到上述蛋白溶液中,混匀并在37 ℃酶解16 h,使酶解彻底。在超滤离心管15000 r/min离心超滤20 min,收集下层的肽段滤液,待上机检测。

1.2.4 南美白对虾肽段的分离和检测

1.2.4.1 高效液相色谱-飞行时间质谱法 液相色谱条件:色谱柱为安捷伦AdvanceBio Peptide Map column(150 mm×2.1 mm,130 Å,2.7 μm);柱温:40 ℃。流动相A:0.1%甲酸-乙腈,流动相B:0.1%甲酸-水;流速:0.25 mL/min;进样量:30 μL;进样时间:46 min;流动相梯度:0～2 min(95% B),2～17 min(95%～80% B),27～37 min(85%～65% B),37～39 min(65%～20% B),39～42 min(20%～95% B),42～46 min(95% B)。质谱条件:质谱扫描范围为350～1500 Da,正离子反应模式,雾化气GS1:35 psi,辅助加热器GS2:45 psi,气帘气压:35 psi,喷雾电压5500 eV,离子源温度:500 ℃,解簇电压:100 V,碰撞能量:10 eV,信号强度阈值:2e4。

1.2.4.2 高效液相色谱-三重四级杆质谱法

传输离子对的确定:为了提高过敏原肽段的灵敏度和选择性,使用Skyline软件产生传输离子对,并优化传输离子对的碰撞能量(CE)和解簇电压(DP),建立三重四级杆MRM的方法。每条肽段选择5对响应强度最高的传输离子对,驻留时间设置为5 ms。通过检测肽段的传输离子对来鉴定肽段,并使用肽段来表征过敏原蛋白。

高效液相色谱-三重四级杆质谱参数:液相色谱条件:色谱柱为安捷伦Advance Bio Peptide Map column(150 mm×2.1 mm,130 Å,2.7 μm);柱温:40 ℃。流动相A:0.1%甲酸-乙腈,流动相B:0.1%甲酸-水;流速:0.35 mL/min;进样量为20 μL;流动相梯度:0～0.5 min,5% B;0.5～17 min,5%～35% B;17～17.5 min,35%～95% B;17.5～20 min,95% B;20～20.1 min,95%～5% B;20.1～25 min,5% B。质谱条件:正离子模式,喷雾电压为5500 V,雾化气为35 psi,离子源温度为575 ℃。

1.3 数据处理

质谱和计算机采集肽段质荷比和保留时间、响应强度等数据,生成wiff文件,导入Protein Pilot软件,检索NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)南美白对虾(LitoLitopenaeus vannamei)的蛋白数据库。ProteinPilot软件参数设置如下:搜库方法:Paragon method;消化:Trypsin;仪器:TripleTOF 5600;物种:None;ID Focus:Amino acid Subtitutions,Biological modifications;Search Effort:Thorough ID;检测蛋白质阈值(Unused Protscore(conf)):>0.05%(10.0%);提交错误发现率(False Discovery rate analysis,FDR)分析报告。

2 结果与分析

2.1 南美白对虾提取液蛋白含量的测定结果

2.1.1 标准曲线的建立 以牛血清蛋白含量为横坐标,650 nm处吸光值为纵坐标,线性回归方程为:y=2.7834x+0.0149(R2=0.9975),绘制的标准曲线如图1所示。

图1 蛋白含量标准曲线Fig.1 Standard curve of protein content

2.1.2 南美白对虾提取液中的蛋白含量 采用稀释100倍的样品,测得650 nm处的吸光值平均数为0.601,换算成提取液蛋白含量为20.7 mg/mL。

2.2 南美白对虾蛋白胰蛋白酶降解产物的分析

2.2.1 高效液相色谱-飞行时间质谱分析 南美白对虾蛋白胰蛋白酶降解产物经高效液相色谱-飞行时间质谱检测分析,观察得到的谱图,发现其谱峰尖锐,峰形较为对称,数据采集情况良好,谱图重现性好。高效液相色谱-飞行时间质谱上南美白对虾蛋白胰蛋白解产物得到的有代表性的总离子流色谱图如图2所示。

图2 高效液相色谱-飞行时间质谱上南美白对虾 蛋白胰蛋白解产物得到的有代表性的总离子流色谱图Fig.2 Representative total ion chromatogram (TIC)scan spectra of hydrolysate of Litopenaeus vannamei on HPLC-QTOF

南美白对虾蛋白胰蛋白酶降解产物经超高效液相色谱-飞行时间质谱检测,采集的数据在Protein Pilot软件中用NCBI的南美白对虾数据库进行谱库检索。在95%的置信度下,共鉴定出7种过敏原,分别是原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌球蛋白轻链、血蓝蛋白亚基L1、血蓝蛋白亚基L2、血蓝蛋白亚基L3、肌钙蛋白C1,对应的肽段条数分别为214、16、84、145、225、163和93条。表1列出了南美白对虾中过敏原的蛋白名称和NCBI中的登记号,以及每个过敏原蛋白对应的响应强度最高的10条肽段。

表1 南美白对虾中的过敏原及代表性肽段Table 1 Allergens of Litopenaeus vannamei and representative peptides

2.2.2 高效液相色谱-三重四级杆质谱分析

2.2.2.1 产生传输离子对 Skyline软件产生的传输离子对及对应的碰撞能量和解簇电压如表2所示。为了简化说明,仅选取3条代表性的过敏原肽段作为示例。

表2 Skyline预测的南美白对虾过敏原代表性肽段解簇电压和碰撞能量Table 2 The declustering potential and collision energy values of representative peptide of Litopenaeus vannamei predicted by Skyline

2.2.2.2 MRM结果 高效液相色谱-三重四级杆质谱上南美白对虾蛋白胰蛋白解产物得到的的总离子流色谱图和提取离子流色谱图如图3所示。图4为南美白对虾过敏原代表性肽段DNAMDR的提取离子色谱图和二级质谱图,母离子为361.15,子离子分别为492.22、421.19、290.15、175.12、230.08,其保留时间为1.58 min。图5为南美白对虾过敏原代表性肽段LSSLEGELK的提取离子色谱图和二级质谱图,母离子为488.27,子离子分别为862.45、775.42、575.30、446.26、201.12,其保留时间为7.67 min。图6为南美白对虾过敏原代表性肽段SEEEVHNLQK的提取离子色谱图和二级质谱图,母离子为635.30,子离子分别为795.44、696.37、559.31、217.08、475.17,其保留时间为2.10 min。

图3 南美白对虾胰蛋白酶解产物在高效液相色谱-三重四级杆质谱上的总离子流图和提取离子流色谱图Fig.3 Representative total ion chromatogram(TIC)scan spectra and extracted ion chromatogram(XIC) scan spectra of hydrolysate of Litopenaeus vannamei on triple quadrupole mass spectrometer注:A为总离子流色谱图,B为提取离子流色谱图。

图4 肽段DNAMDR的提取离子色谱图和二级质谱图Fig.4 Representative extracted ion chromatogram(XIC) scan spectra and secondary ion mass spectrometry(SIMS)of peptide DNAMDR注:a～e为提取离子色谱;f为二级质谱图;图5～图6同。

图5 肽段LSSLEGELK的提取离子色谱图和二级质谱图Fig.5 Representative extracted ion chromatogram(XIC) scan spectra and secondary ion mass spectrometry(SIMS)of peptide LSSLEGELK

图6 肽段SEEEVHNLQK的提取离子色谱图和二级质谱图Fig.6 Representative extracted ion chromatogram(XIC)scan spectra and secondary ion mass spectrometry(SIMS)of peptide SEEEVHNLQK

3 结论

采用高效液相色谱-飞行时间质谱共检测出南美白对虾中7种过敏原,分别是原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌球蛋白轻链、血蓝蛋白亚基L1、血蓝蛋白亚基L2、血蓝蛋白亚基L3、肌钙蛋白C1,对应的肽段条数分别为214、16、84、145、225、163和93条。高效液相色谱-飞行时间质谱通过检测母离子和子离子的精确质量数,结合数据库检索可以匹配出肽段。高效液相色谱-三重四级杆质谱的MRM模式灵敏度高、选择性好、操作简单,但是需要预先设定母离子和子离子。本研究建立了一种检测南美白对虾过敏原的新思路:从高分辨飞行时间质谱发现过敏原的肽段到三重四级杆MRM方法的开发。本研究有助于进一步认识过敏原,为水产品的食用安全性提供一定的基础理论依据。