姚 瑶，王宏宇，安 军 ，王 意，朱泊羽，高 飞，徐 春

胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是人体内存在的一种生理性多肽。进食能刺激肠黏膜上的朗格汉斯细胞（L细胞）释放GLP-1。GLP-1的生理学作用较为广泛：促进葡萄糖依赖性胰岛素分泌、抑制胰高血糖素释放、刺激胰岛B细胞增殖和再生、抑制胰岛B细胞凋亡、减弱胃肠蠕动、延缓胃排空、增加饱腹感、增加葡萄糖利用、改善胰岛素敏感性等[1,2]。GLP-1主要通过作用于其受体（GLP-1 receptor，GLP-1R）发挥作用，由于GLP-1R在胰岛及胰岛外组织中均有表达，所以GLP-1作用范围广泛，对内分泌、消化、神经、心血管、泌尿和呼吸等多个系统、器官均有作用[3]。

在胰岛细胞中，GLP-1直接与细胞膜上的GLP-1R结合，促进cAMP水平升高，激活cAMP/PKA依赖和非依赖通路[4]。除了胰岛细胞，GLP-1也能在肝细胞中发挥作用，其间接作用方式指GLP-1促进胰岛素分泌，胰岛素激活肝细胞上信号通路PI3K/Akt/mTOR；肝细胞上是否存在GLP-1R目前仍有争议，所以GLP-1对肝细胞的直接作用方式还需更多研究支持[5]。Sancho等[6]研究指出GLP-1对肝细胞的直接作用可能与蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、核糖体蛋白S6激酶（ribosomal protein S6 kinase，P70S6K）的激活有关。GLP-1（7-36）是GLP-1的主要活性形式。重组人胰高血糖素样肽-1（7-36）[recombinant human glucagon like peptide-1（7-36），rhGLP-1（7-36）]与人体内GLP-1活性成份的氨基酸序列相同，因此本研究用rhGLP-1（7-36）处理人正常肝细胞系HL-7702，观察其不同作用时间对胰岛素信号通路中Akt、P70S6K蛋白表达的影响，为研究GLP-1对肝细胞的直接作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自杭州四季青生物工程有限公司，RPMI1640培养基购自英国Gibco公司，rhGLP-1（7-36）购自上海仁会生物制药股份有限公司，兔来源P70S6K单克隆抗体购自美国Millipore公司，兔来源p-AktThr308单克隆抗体、兔来源p-AktSer473单克隆抗体、兔来源Akt单克隆抗体、辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）标记抗鼠/兔IgG均购自美国Cell Signaling Technology公司，鼠来源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体购自上海康成生物工程有限公司，脱脂奶粉购自上海碧迪医疗器械有限公司，其他常用试剂为进口或国产分析纯化。

1.1.2 仪器 CO2恒温细胞培养箱购自美国Thermo Forma公司，化学发光凝胶成像系统购自美国Aplegen公司，SynergyHT酶标仪购自美国BioTek公司。

1.1.3 实验细胞 人肝细胞系HL-7702细胞株购自上海中科院细胞所，培养条件：在37 ℃、5% CO2的湿化培养箱中，用10% FBS的RPMI1640培养基培养。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及处理 培养人肝细胞系HL-7702细胞株至对数生长期，按5×105/ml的密度均匀接种于60 mm培养皿上，随机分为实验组与对照组。两组在37 ℃、5% CO2的湿化培养箱中培养24 h，弃去旧培养基，实验组用含有100 nM rhGLP-1（7-36）的10% FBS的RPMI1640培养基进行不同时间的处理（0 min、10 min、60 min、90 min）；对照组用含有等量10% FBS的RPMI1640培养基进行不同时间的处理（0 min、10 min、60 min、90 min）。

1.2.2 蛋白质免疫印迹法（Western Blot） 检测Akt蛋白、P70S6K蛋白的表达水平。各组细胞处理后，弃掉培养基，分别用预冷的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer solution，PBS）洗两遍。每组细胞加入适量RIPA裂解液（内含终浓度为1 mmol/L的苯甲基磺酰氟、氟化钠、正钒酸钠），4 ℃放置15 min。充分裂解后，收集裂解液至离心管中，离心机调至r=8.5 cm、rcf=16 000×g，离心20 min。收集上清液，采用bicinchonininca cid（BCA）法测定蛋白浓度并分装。制备8%分离胶和5%浓缩胶，与上清液混合，沸水中加热5 min至蛋白变性，蛋白上样电泳。再于100 V电压下将蛋白转至硝化纤维膜上。将膜用含5%脱脂奶粉的封闭液孵育3 h，用Tris-HCl缓冲盐溶液加Tween-20（TBS-T）洗5 min，孵育一抗，4 ℃过夜。TBS-T洗膜3次，每次5 min，室温下孵育二抗1 h。再次用TBS-T洗膜3次，每次5 min。用化学发光凝胶成像系统进行检测，用Image J软件进行灰度分析。所有实验均重复3次以上。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学处理。各组数据均以±s表示。数据整体分析采用两因素重复测量方差分析，不同时间点下实验组与对照组比较用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，显著性水平进行Bonferroni校正；实验组或对照组多个时间点下比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 rhGLP-1（7-36）对Akt蛋白及磷酸化Akt蛋白表达水平的影响 用浓度为100 nM的rhGLP-1（7-36）分别处理人HL-7702肝细胞系0 min、10 min、60 min、90 min后，实验组与对照组比较，Akt表达量无明显变化；0 min、10 min、60 min时，AktSer473位点磷酸化水平无明显变化；90 min时，Akt Ser473位点磷酸化水平显著升高，差异有统计学意义（t=-5.405，P=0.012，表1、图1）。实验组与对照组比较，0 min时AktThr308位点磷酸化水平无明显变化；10 min、60 min时，Akt Thr308位点磷酸化水平升高，但差异无统计学意义（P＞0.05，表1、图1）；90 min时，Akt Thr308位点磷酸化水平显著升高，差异有统计学意义（t=-5.596，P=0.011，表1、图1）。

2.2 rhGLP-1（7-36）对P70S6K蛋白及磷酸化P70S6K蛋白表达水平的影响 实验组用浓度为100 nM的rhGLP-1（7-36）分别处理人HL-7702肝细胞系0 min、10 min、60 min、90 min后，与对照组相比，P70S6K蛋白表达量无明显变化。与对照组相比，10min、60 min时磷酸化P70S6K蛋白表达水平升高，但差异无统计学意义（P＞0.05，表2、图2）；90 min时显著升高，差异具有统计学意义（t=-5.597，P=0.011，表2、图2）。

表1 rhGLP-1（7-36）处理HL-7702细胞不同时间点对Akt的影响

表1 rhGLP-1（7-36）处理HL-7702细胞不同时间点对Akt的影响

注：Akt，蛋白激酶B；与对照组比较，① P＜0.05

0 min 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 10 min 0.91±0.13 0.97±0.13 0.86±0.10 0.92±0.16 0.95±0.03 0.80±0.30 60 min 0.93±0.11 0.98±0.13 0.90±0.10 1.32±0.56 1.03±0.05 0.94±0.37 90 min 0.95±0.05 0.98±0.16 0.95±0.12 1.82±0.28① 1.02±0.08 1.21±0.12①

图1 rhGLP-1（7-36）处理HL-7702细胞不同时间点对Akt的影响

表2 rhGLP-1（7-36）处理HL-7702细胞不同时间点对P70S6K蛋白的影响±s）

表2 rhGLP-1（7-36）处理HL-7702细胞不同时间点对P70S6K蛋白的影响±s）

注：P70S6K，核糖体蛋白S6激酶；与对照组比较，①P＜0.05

0 min 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 10 min 1.12±0.17 1.02±0.07 1.12±0.07 1.19±0.39 60 min 1.10±0.27 1.07±0.20 1.14±0.25 1.70±0.55 90 min 1.13±0.22 1.21±0.28 1.09±0.16 2.13±0.25①

图2 rhGLP-1(7-36)处理HL-7702细胞不同时间点对P70S6K蛋白的影响

3 讨 论

GLP-1通过刺激胰岛素释放降低血糖[7]。目前，越来越多的研究发现GLP-1可不通过胰岛素直接作用于胰岛素的靶器官。Seghieri等[8]研究发现GLP-1直接作用于肝脏，抑制肝脏内源性葡萄糖的产生。Dhanesha等[9]也发现GLP-1R激动剂艾塞那肽-4可使糖尿病大鼠肝脏糖原激酶活性加强，恢复肝糖原合成能力，与此同时体内胰岛素水平无明显变化。这些研究提示GLP-1可直接作用于肝脏，通过非胰岛素作用机制降低血糖。目前GLP-1直接作用于肝脏的机制尚未清楚，有研究指出可能与Akt的激活有关。Redondo等[10]用Akt、P70S6K抑制剂发现GLP-1激活糖原合酶a的效应明显下降，说明GLP-1通过激活Akt使肝细胞中的糖原合酶a活化，促进糖原合成。

本研究发现用rhGLP-1（7-36）作用于人肝细胞系HL-7702细胞时，磷酸化Akt蛋白与磷酸化P70S6K蛋白表达水平都增加，并且在90 min时磷酸化作用最明显。说明rhGLP-1（7-36）可促进肝细胞Akt、P70S6K的磷酸化，激活Akt/mTORc/P70S6K信号通路。Akt/mTORc/P70S6K信号通路活化与肝脏脂肪代谢有关。有学者指出小鼠体内过表达Akt时，会出现高甘油三酯血症，同时伴有脂肪肝和肝肿大[11,12]。当用雷帕霉素抑制mTORc1时，P70S6K蛋白磷酸化水平下降，脂肪合成的基因SREBP-1c受抑制，脂肪合成减少[13]。本研究发现GLP-1可激活Akt/mTORc/P70S6K信号通路，提示GLP-1可能通过激活这条通路，上调脂肪合成基因SREBP-1c，促进肝脏脂肪合成。然而，临床研究证明在糖尿病患者及肥胖人群中，GLP-1类的药物能改善肝脏的脂肪变性。用GLP-1类似物处理小鼠时能逆转肝脏的脂肪变性[14]。这些研究均提示GLP-1能减少肝脏脂肪的合成，这与本研究的结果不相符，提示GLP-1还可能通过激活其他信号通路，比如AMPK信号通路调节脂质代谢[15-20]。因此，笔者下一步需研究GLP-1与AMPK通路的关系，为进一步研究GLP-1调节肝脏脂肪代谢的机制提供依据。