安荟羽，唐成林，黄思琴，赵丹丹，罗翱，吴梦佳，谭程方，邱丽，万小凤，马翔

1.重庆医科大学中医药学院，重庆市400016；2.中医药防治代谢性疾病重庆市重点实验室，重庆市400016

肌肉纤维的形成以及肌肉运动的发生依赖于周围神经元的正常工作[1]。周围神经损伤后，骨骼肌失去神经支配，进而缺失营养导致肌肉收缩功能、反应能力丧失，体积变小，发生萎缩[2]。去神经支配诱导的肌肉废用可激活肌肉中的自噬信号传导途径，细胞自噬活性升高，清除受损胞质和细胞器[3]。细胞自噬对保持肌肉质量和肌纤维的完整性非常重要[4]。马书杰等[5-6]研究发现，推拿手法在一定程度上可促进骨骼肌卫星细胞增殖并分化为成熟肌纤维，延缓失神经后骨骼肌萎缩。说明推拿对延缓失神经骨骼肌萎缩有效，但其具体机制还需要进一步研究。

本课题组前期研究[7-9]表明，电针在失神经后期(8周)可能通过调控自噬相关基因表达，抑制自噬过度激活，从而维持骨骼肌细胞稳态，延缓失神经骨骼肌萎缩，也可通过抑制肌细胞的凋亡、促进肌卫星细胞增殖，来延缓失神经骨骼肌萎缩。

本研究观察推拿在不同时间点对前期失神经骨骼肌萎缩大鼠腓肠肌中自噬相关基因Beclin-1、液泡分选蛋白34(vacuolar protein sorting,Vps34)、微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)的影响，从自噬活性水平变化的角度，探讨推拿延缓失神经骨骼肌萎缩的可能机制，为临床上运用推拿治疗失神经导致的肌萎缩提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠77只，体质量(220±10)g，由成都达硕实验动物有限公司提供，动物合格证号SCXK(川)2015-030，代养于重庆医科大学动物实验中心ⅠVC级动物房。实验过程中对动物的处理完全符合重庆医科大学医学研究伦理委员会标准。

1.2 主要试剂与仪器

Beclin-1、 Vps34、 LC3、 β-actin 引 物 合 成 、RR037A逆转录试剂盒、RNAiso Plus试剂、SYBR®Premix Ex Taq TMⅡ：日本TAKARA公司。DEPC水：碧云天生物科技有限公司。大鼠柔性固定器：温州原上草医疗科技有限公司。AFY-10型小动物按摩器：天津。CellSens Standard图像采集软件和BX53普通正置显微镜：日本OLYMPUS公司。AL204型电子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司。低温高速离心机：日本SⅠGMA公司。Thermo ND 2000超微量核酸蛋白测定仪：上海GENE公司。CFX PCR检测系统、T100TMPCR仪：美国BⅠO RAD公司。

1.3 模型制备及分组

所有大鼠适应性喂养1周后，依次编为1～77号，用计算机自动生成77个两位数随机数字表，每一个编号对应一个随机数字，然后按随机数字大小重新排列序号，序号1～7作为假手术组(n=7)，8～42作为模型组(n=35)，43～77作为推拿组(n=35)。

模型组和推拿组4%水合氯醛0.8 ml/100 g腹腔注射麻醉，俯卧固定在手术台，在无菌条件下右后肢手术区消毒备皮，右后肢股后外侧作切口，钝性分离股二头肌，玻璃分针分离胫神经，眼科剪剪断1.0 cm，造成神经缺损，逐层缝合，伤口消毒[10]。

假手术组只暴露神经，不离断神经。

1.4 干预方法

造模后第2天，推拿组于每天14：00进行干预。用大鼠柔性固定器固定大鼠，待其情绪稳定后，将小动物按摩器按摩头固定于大鼠术侧下肢，让按摩头对萎缩肌肉进行推拿干预，设置按摩头转速2600 r/min，推拿时间15 min，每天1次[11]。假手术组和模型组每天只固定，排除固定时的应激反应所导致的误差。

1.5 标本采集

假手术组在第28天取材，模型组和推拿组分别在造模后第0、7、14、21、28天随机各取7只大鼠取材。大鼠称重，4%水合氯醛0.8 ml/100 g腹腔注射麻醉，快速完整剥离腓肠肌，PBS缓冲液清洗，吸干表面残留液体，电子天平称重，并仔细观察腓肠肌萎缩情况(肌肉弹性、色泽和饱满度)。称重后将取下的腓肠肌分为两份，一份用肌肉固定液固定，用于形态学检测；一份放入液氮罐中冻存，-80℃冰箱保存待测。0 d组在术后待其麻醉效果失效转醒，确认无死亡且造模成功后即刻取材，不做任何干预。

1.6 指标检测

1.6.1 腓肠肌湿重比

取材时迅速完整剥离双侧腓肠肌，以近端于股骨内、外髁起点剪下，远端于跟腱止点处剪断为准，清除表面血管和神经，电子天平称重，以自身体质量作为对照，计算腓肠肌湿重比。

1.6.2 肌纤维截面积和直径

将肌肉固定液固定后的腓肠肌，乙醇脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，在400×光学显微镜下观察，每张切片随机采取5个视野的图像，通过Ⅰmage Pro Plus 6.0分析软件分析图像并计算腓肠肌肌纤维截面积和直径。

1.6.3 逆转录实时定量聚合酶链反应(reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测腓肠肌Beclin-1、Vps34和LC3 mRNA表达

从-80℃冰箱中取出腓肠肌组织样本约50 mg，加入Trizol，匀浆，加氯仿，离心，提取上清液；加异丙醇静置后离心，酒精清洗3次后晾干，加入DEPC水；在超微量核酸蛋白测定仪上检测总RNA浓度和纯度，按反转录试剂盒操作步骤配置反应体系，于T100TMPCR仪中进行反转录反应；SYBR Green法配置反应体系，加样，上机，进行RT-qPCR反应。采用CFX manager 3.1 软件读取Ct值。计算2-△△Ct。上下游引物序列见表1。

1.7 统计学分析

表1 待测基因引物序列

2 结果

2.1 腓肠肌湿重比

组间比较，三组0 d时腓肠肌湿重比无显著性差异(P＞0.05)；其他时间点，模型组和推拿组均较假手术组下降(P＜0.05)，推拿组除21 d外，腓肠肌湿重比均高于模型组(P＜0.05)。组内比较，模型组和推拿组腓肠肌湿重比随时间进行性显著下降(P＜0.001)，术后0 d最大，28 d最小。见表2。

2.2 形态学

假手术组与其他组0 d术侧腓肠肌纤维形态正常，边缘规则；其余各时间各组肌纤维随时间延长呈缩小趋势，边缘不规则，推拿组较模型组肌纤维大且边缘较规则。

表2 各组腓肠肌湿重比比较(×10-3)

表3 各组肌纤维截面积比较(μm2)

三组0 d时肌纤维截面积和直径无显著性差异(P＞0.05)。其他时间点，与假手术组比较，模型组和推拿组(除推拿组7 d)均下降(P＜0.05)，推拿组(除7 d)均高于模型组(P＜0.05)。组内比较，模型组截面积和直径随时间进行性显著下降(P＜0.001)，14 d与21 d组无显著性差异(P＞0.05)；推拿组截面积在14 d后进行性显著下降(P＜0.001)，直径在21 d后进行性显著下降(P＜0.001)。见图1，表3、表4。

2.3 RT-qPCR

三组0 d时各项Beclin-1、Vps34和LC3的mRNA表达均无显著性差异(P＞0.05)。其他时间点，与假手术组比较，模型组术侧腓肠肌Beclin-1 mRNA(除14 d)、Vps34 mRNA(除7 d)表达均升高(P ＜ 0.05)，模型组21 d LC3 mRNA表达升高(P＜0.05)；推拿组Be-clin-1、Vps34 mRNA表达以及LC3 mRNA表达(除14 d)均升高(P＜0.05)，推拿组各项mRNA表达(除14 d以及Vps mRNA 28 d组)均高于模型组(P＜0.05)。

组内比较，随实验时间延长，模型组Beclin-1和Vps34 mRNA表达在21 d后呈上升趋势(P＜0.05)，LC3 mRNA表达在21 d升高(P＜0.05)；推拿组Beclin-1 mRNA表达呈先上升后下降的趋势(P＜0.05)，Vps34和LC3 mRNA表达(除14 d)呈先上升后下降的趋势(P＜0.05)，术后0 d最小。见表5～7。

表4 各组肌纤维直径比较(μm)

表5 各组术侧腓肠肌Beclin-1 mRNA表达比较(2-△△Ct)

表6 各组腓肠肌Vps34 mRNA表达比较(2-△△Ct)

表7 各组腓肠肌LC3 mRNA表达比较(2-△△Ct)

3 讨论

中医将各种类型的肌萎缩归为“痿证”的范畴，失神经肌萎缩急性期属于气滞血瘀型，恢复期则属于各种虚症如气血亏虚、肝肾不足等。传统中医理论将推拿的作用原理概括为平衡阴阳、调和脏腑、疏通经络、行气活血等[12]，可防治失神经肌萎缩。

骨骼肌失神经后，会导致肌细胞凋亡、肌肉蛋白质降解大于合成、失去营养因子的营养作用及生理电刺激、神经-肌肉接头处运动终板退化、肌卫星细胞耗竭、骨骼肌毛细血管退化，造成肌组织相对缺氧，线粒体和各种酶变化等[13-14]。这些都是失神经骨骼肌萎缩的发病机制，其中失神经后失去营养因子的营养作用会使细胞自噬的活性升高。

图1 各组大鼠腓肠肌不同时间点HE染色(bar=50μm)

推拿是临床治疗失神经性肌萎缩的常见疗法，效果显著。郭汝宝等[15-17]的研究表明，推拿手法早期可促进腓肠肌Ⅰ型肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC-Ⅰ)与MHC-Ⅱ的相对表达量增加，改善骨骼肌结构改建能力；促进肌卫星细胞的增殖和胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,ⅠGF-Ⅰ)表达；增加复合肌肉动作电位波幅、收缩力和收缩位移，改善复合动作电位和收缩功能，延缓骨骼肌失神经后肌萎缩，促进骨骼肌再生修复。而本实验发现推拿能够促进细胞自噬活性，清除损伤细胞器和蛋白质，为肌纤维再生提供一定的合成底物和能量，从而减轻失神经骨骼肌萎缩的程度。

自噬是细胞自我消化、降解和维持内环境稳定的重要机制[18]。在正常的生理条件下，细胞自噬保持基础水平，以维持细胞内环境稳定；营养缺乏和能量不足的条件下，一部分细胞质和细胞器被包裹进自噬体，自噬体再与溶酶体融合成自噬溶酶体，受损的胞质和细胞器等大分子物质被降解为核苷酸、氨基酸、游离脂肪酸等小分子物质，被重新利用合成大分子或能量物质ATP[19]。这个过程可以使机体在严峻的生存条件下通过自我降解以提供能量和营养成分保证生存，同时也可以清除侵入体内的病原体[18]。参与自噬过程的基因主要指一系列的自噬相关基因(autophagy associated gene,Atg)。哺乳动物Beclin-1是酵母Atg6/Vps30基因的同源物，主要定位于反面高尔基体、内质网和线粒体，能介导其他自噬蛋白质定位于自噬前体[20]。Vps34与Beclin-1、Vps15形成Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶复合物(phosphatidylinositol 3-kinase ClassⅢcomplex,PⅠ3KC3)，可磷酸化磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PⅠ)，生成 3-磷酸磷脂酰肌醇(PⅠ3-phosphate,PⅠ3P)，而PⅠ3P募集胞浆中其他自噬相关蛋白Atg结合到自噬前体膜上，在自噬体形成早期发挥重要的作用[21]。LC3参与自噬体膜的形成，包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种可相互转化的形式，细胞内新合成的LC3经过剪切修饰成为胞浆可溶形式的LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ经泛素化加工修饰，与自噬体膜表面的PE结合成为膜结合形式的LC3-Ⅱ；LC3-Ⅱ定位于自噬前体和自噬体，随着自噬体膜的增多而上调，是自噬体的标志分子[22]。LC3-Ⅱ的含量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值与自噬体的数量呈正相关，其含量或比值下降提示自噬活性降低，反之提示活性升高[23]。

邱守涛等[24]发现在SAMP6快速衰老小鼠模型中，降解机制障碍导致自噬水平降低，这可能参与骨骼肌衰减的发生，耐力运动可有效提高自噬水平而缓解骨骼肌衰减。Lira等[25]检测C57BL/6小鼠自主运动1个月后趾肌自噬相关基因的表达时，发现自噬基因Beclin-1和LC3等增加，认为细胞自噬对骨骼肌维持收缩活动和发挥功能有重要作用。MacKenzie等[26]认为，抗阻训练通过激活mVps34-Beclin-1复合物通路，上调细胞自噬水平来降解受损的细胞器和蛋白质，能有效维持骨骼肌质量。Masiero等[4]发现，在敲除小鼠自噬基因Atg7后，自噬的抑制并不会在分解代谢的条件下保持肌肉的质量，且在去神经的过程中会加剧肌肉的流失。上述研究表明，自噬的激活可以增加受损细胞器和蛋白质的降解，为细胞再生提供一定的合成底物和能量，缓解肌肉的萎缩，维持肌肉的质量、收缩活动和功能的发挥。然而，Feng等[27]研究发现，过度训练可使肌肉萎缩相关基因MuRF1、Atrogin-1和自噬相关基因LC3、Atg7、Beclin-1、FoxO3表达增加，引起细胞自噬过度激活，过多降解骨骼肌细胞质中的蛋白质和细胞器等主要成分，使肌肉发生萎缩，肌肉活动和功能下降。说明细胞自噬的过度激活，也会造成肌肉的萎缩，这对于肌肉萎缩的治疗是一把“双刃剑”，适当促进自噬以缓解肌肉萎缩非常重要。

本研究表明，模型组腓肠肌Beclin-1 mRNA表达在7 d、21 d和28 d高于假手术组，Vps34 mRNA表达在14 d、21 d和28 d高于假手术组，LC3 mRNA表达在21 d高于假手术组，提示大鼠失神经后，随时间延长，细胞自噬活性升高。推拿干预后，推拿组腓肠肌肌湿重比、截面积和直径高于模型组，提示骨骼肌萎缩减轻，推拿治疗有效且具有持续性。同时发现，在7 d、21 d和28 d中，推拿组腓肠肌Beclin-1、LC3 mRNA和Vps34 mRNA(除28 d)表达高于模型组，提示推拿干预后，细胞自噬活性增强，推拿治疗可能是通过促进细胞自噬活性，减轻失神经骨骼肌萎缩的程度。推拿组28 d时腓肠肌Beclin-1、Vps34和LC3 mRNA表达低于21 d，提示在28 d时，推拿治疗促进自噬活性增强的作用在下降，但仍是促进自噬。本课题组前期研究表明，电针在失神经8周时抑制自噬过度激活，延缓失神经骨骼肌萎缩[7]。因此，推拿治疗是否在后期会抑制自噬，以及推拿如何对自噬进行调控以减轻失神经肌萎缩程度的具体机制，还需进一步研究。

综上所述，推拿治疗失神经肌萎缩的机制可能是通过上调自噬相关因子Beclin-1、Vps34和LC3的mRNA表达，促进细胞自噬的激活，清除损伤细胞器和蛋白质，为肌纤维再生提供一定的合成底物和能量，从而减轻失神经骨骼肌萎缩的程度。