杨之雪，唐成林，李小宏，朱正威，黄思琴，代妮，吴梦佳，邱丽，安荟羽

1.重庆医科大学中医药学院，重庆市400016；2.重庆医科大学附属第一医院康复医学科，重庆市400016

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种神经退行性疾病，目前全球约有4680万AD患者，预计到2050年，全球将有超过1.35亿人患此病[1]。AD的主要临床表现为进行性记忆下降和认知障碍，给社会、家庭带来沉重的精神和经济负担。目前，临床治疗只能暂时缓解症状，多采用药物如胆碱酯酶抑制剂盐酸多奈哌齐。由于AD后血脑屏障结构改变，对小分子药物具有潜在影响。AD患者脑血流量减少，影响中枢神经系统对化合物的吸收；紧密连接紊乱，血脑屏障通透性增加，基底膜增厚，以及构成大脑微循环网络的毛细血管密度整体降低和相关结构缺失，减少重要营养物质在血脑屏障的转运，也许是阻碍药物进入中枢神经系统，无法发挥最大疗效的原因之一[2-4]。电针治疗AD越来越广泛，针药结合治疗AD可以增加药效，延缓病情发展，取得显著成效[5]。

本研究通过观察快速老化痴呆模型小鼠SAMP8小鼠海马区血脑屏障紧密连接、基底膜结构和紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5、Occludin mRNA相对表达量的改变，探讨电针改善SAMP8小鼠血脑屏障结构的机制，为临床针药结合治疗AD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

30周龄雄性SAMP8小鼠28只，及其同源抗快速老化SAMR1小鼠7只，体质量28～35 g，北京中科泽晟科技有限公司培育，清洁级，实验动物许可证号SCXK(京)2014-0011。动物饲养于重庆医科大学动物实验中心ⅠVC级动物房，实验动物许可证号SYXK(渝)2018-0003。分笼饲养于明暗12 h交替的恒温恒湿环境，自由摄食和水。适应性喂养1周后，SAMP8小鼠按随机数字表法分为模型组、电针组、药物组和针药组，SAMR1小鼠为对照组，每组均为7只。

实验过程中，所有操作符合重庆医科大学实验动物伦理相关使用要求。

1.2 仪器与试剂

盐酸多奈哌齐片(安理申)：卫材制药有限公司。华龙无菌针灸针：直径0.17 mm，长7 mm，北京大名科技有限公司。SDZ-Ⅱ型电子针疗仪：苏州医疗用品厂有限公司。低温高速离心机：美国SⅠGMA公司。ER-182A型电子天平：日本A&D有限公司。Trizol总RNA提取液、RR037 A反转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，ZO-1、Claudin-5、Occludin、β-actin引物：日本TAKARA公司。AL 204型电子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司。ThermoND 2000超微量核酸蛋白测定仪：上海GENE公司。CFX ConnectTM荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测系统：美国BⅠO RAD公司。T 100TMPCR仪、EDTA(pH=8.0)抗原修复液、EDTA(pH=9.0)抗原修复液、柠檬酸(pH=6.0)抗原修复液、BSA、正常兔血清、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)一抗、二抗组化试剂盒DAB显色剂：武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.3 方法

电针组和针药组小鼠固定于泡沫板上，用一次性无菌针灸针刺百会、印堂两穴[6]，接电针仪，连续波，频率2 Hz，电流1.0 mA，每次15 min[7]。药物组和针药组予安理申，研钵研磨后混于生理盐水，浓度0.1 g/L，4℃保存，10 ml/kg灌胃，每天1次[8]。模型组和对照组每日正常抓取1次。6 d为1个疗程，疗程间隔1 d，连续4个疗程。

以上实验操作，均在固定时间由固定操作人员完成。

1.4 取材及检测

1.4.1 取材

干预结束后，小鼠用4%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉，打开胸腔，暴露心脏，心尖灌注0.9%氯化钠溶液约40 ml，剪开右心耳，待小鼠肝脏完全变白且右心耳流出澄清液体后，每组取6只断头取脑，小鼠右半脑分离海马和皮质，-80℃保存；左半脑多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片。

另1只小鼠继续灌注1%戊二醛溶液，至小鼠肢体和尾巴僵硬，断头取脑，修剪海马约1×1×1 mm，2.5%戊二醛中4℃固定。以上均在冰上操作。

0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，1%锇酸固定液后固定，再漂洗3次。酒精和丙酮4℃梯度脱水，100%丙酮室温脱水，包埋后烘箱内固化，超薄切片机切片，厚70 nm，3%醋酸铀-枸橼酸铅染色，Hitachi-7500透射电镜观察海马血脑屏障结构。

1.4.2 免疫组化

石蜡切片行免疫组化染色，加AChE一抗(1∶250)，4℃孵育过夜；加入生物素化二抗，DAB显色，光学显微镜下观察颜色效果，苏木素复染细胞核；脱水封片，常温晾干，在光学显微镜下采图。采用Ⅰmage-Pro Plus 6.0软件以棕黄色作为阳性判断标准，计算积分光密度(integrated optical density,ⅠOD)。

1.4.3 qPCR

取-80℃保存的海马组织，Trizol提取总RNA；加入异丙醇静置10 min，12000 r/min离心15 min，75%酒精清洗2次，自然晾干；加入DEPC水，弹匀；清洗超微量核酸蛋白测定仪探头10次，记录总RNA纯度和污染值，按逆转录试剂盒RR037A操作步骤配制反应体系，置于T100TMPCR仪中逆转录：37℃15 min，85℃5 s，4℃+∞。按照SYBRGreen法配制反应体系，标板，上机行qPCR反应：90℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，95℃5 s，60℃1 min，共40个循环。CFXmanager 3.1软件读取Ct值。以2-ΔΔCt表示每组基因相对表达量。引物序列见表1。

1.5 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件对数据结果进行分析。数据(ˉ±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 电镜

对照组紧密连接结构正常，血管基底膜清晰完整，排列整齐有序。模型组紧密连接为开放状态并且呈空泡状，血管基底膜增厚，边界不清，结构紊乱，基底膜外出现大量不规则絮状条形物，周围组织排列稀疏。电针组紧密连接结构较模型组排列有序，血管基底膜相对变薄。药物组紧密连接部分开放，形成裂隙，结构松弛，基底膜明显增厚，结构模糊紊乱，排列不紧密。针药组紧密连接结构相对完整，排列整齐，细胞间隙光滑、连续，基底膜厚度相对正常，结构层次清晰。见图1。

2.2 AChE

对照组海马细胞排列紧密有序，结构完整。模型组海马细胞层数和数量明显减少，排列紊乱，间隙增大。与模型组相比，电针组海马细胞层数增多，排列相对整齐，间隙稍减小。药物组海马细胞排列较紊乱，细胞间隙增大。与药物组相比，针药组海马细胞排列整齐，结构较完整，细胞层数和数量显著增加。见图2。

图1 SAMP8小鼠海马区紧密连接结构(电镜,×30,000)

图2 各组海马区AChE水平(免疫组化染色,×400)

与对照组相比，模型组海马区AChE显著增多(P＜0.001)；与模型组相比，电针组、药物组和针药组AChE均显著降低(P＜0.001)，其中针药组最低，药物组次之，电针组最高(P＜0.05)。见表2。

表2 各组海马AChE水平比较(ⅠOD)

2.3 紧密连接蛋白mRNA表达

与对照组相比，模型组和药物组ZO-1、Claudin-5和Occludin mRNA表达明显降低(P＜0.01)；与模型组和药物组比较，电针组和针药组ZO-1、Claudin-5和Occludin mRNA相对表达量均明显上调(P＜0.01)，与对照组无显著性差异(P＞0.05)。见表3。

表3 各组ZO-1、Claudin-5和Occludin mRNA表达(2-△△Ct)

3 讨论

AD是一种与年龄相关的神经退行性疾病，特征是认知和学习能力隐匿性恶化[9]。虽然目前没有治愈AD的方法，但可以通过一些治疗手段延缓AD的发展。临床上多用胆碱酯酶抑制剂盐酸多奈哌齐等。由于药物疗效不显著，AD的治疗面临巨大挑战[10]。

药物要达到脑内治疗部位，需要通过血脑屏障。生理状态下，血脑屏障能够调节血液和大脑间溶质的交换，保护大脑免受外界干扰，维持神经环境稳定[11]。随着年龄增加，血脑屏障受损程度随之增加[12]。同时紧密连接中断，脑血管基底膜增厚，脑血流量减少。这些都会影响药物的吸收，最终影响临床治疗效果[4,13]。血脑屏障结构功能紊乱，不仅导致多种神经毒性分子渗漏，引发并加重AD，而且异常的血管分支和增厚的基底膜也降低了脑血流，限制分子进入脑内[14]。一些研究表明[3,11]，大部分药物在AD患者脑中显著减少，可能是由于药物剂量不足，影响了临床治疗效果。根据Fickian扩散定律[2,11]，AD小鼠对中枢神经系统药物吸收量减少可能是由于脑血管基底膜增厚和路径长度增加，血脑屏障渗透性的改变对小分子药物的吸收也有重要影响。由于紧密连接的破坏，改变了大脑血液及小分子的运输途径，异常的血管生成、血流量改变、脑灌注量不足和炎症反应不仅影响药物吸收，还会进一步导致突触和神经功能损害，加重AD[15]。

SAMP8小鼠是公认的模拟AD病理的模型小鼠，特征是认知障碍与学习、记忆能力下降。病理表现有血脑屏障结构紊乱，脑血管缺损，紧密连接受损，基底膜增厚，胆碱能系统改变[12,16-17]。电针作为传统医学与现代医学的有机结合，在治疗中枢神经系统疾病方面取得显著疗效。AD属中医学“痴呆”病的范畴，病位在脑，与肾脏密切相关，并涉及心、肝、脾诸脏。督脉是精微物质上输于脑的重要通路，与五脏六腑均有密切联系，具有振奋阳气，调节脏腑机能，改善机体精神意识和思维活动的作用[18]。一些实验研究针刺百会、印堂治疗AD，均有不错的效果[19]。

紧密连接是血脑屏障保持结构稳定的基础，对血脑屏障具有调节作用。ZO-1是紧密连接中最主要的胞质蛋白，在许多神经功能障碍疾病中，ZO-1缺乏不仅会干扰紧密连接，其水平降低也与屏障破坏相关。Claudin-5是血脑屏障主要的跨膜蛋白，也是调节脑血管内皮细胞通透性的关键靶点，能影响血脑屏障的开放程度，提高药物在脑内的生物利用度。Occludin是第一个被发现的紧密连接蛋白，直接参与紧密连接形成。ZO-1、Claudin-5和Occludin相互作用，将跨膜蛋白和细胞骨架连接，不仅可以识别紧密连接位置，还能传递各类信号，是研究紧密连接的标志蛋白[20-22]，其表达水平下降是血脑屏障损伤程度的重要标志。实验研究发现[23-24]，ZO-1、Claudin-5、Occludin mRNA和蛋白水平的表达均有所减少。尽管AD病理条件下血脑屏障渗透性增加，但小分子药物在脑内的转运率却有所下降[25]，这可能是由于分子复合物在受损的血脑屏障中产生渗漏[26]。调控紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5和Occludin，有可能调节受损屏障结构，增加大脑对药物的吸收。

导致AD患者学习记忆障碍公认的原因之一为胆碱能神经递质缺乏。盐酸多奈哌齐是中枢AChE抑制剂，通过抑制对乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)的水解，增加ACh浓度[18]。由于Ach在体内不稳定，故本研究检测AChE的含量，间接反映ACh水平。

本研究显示，电针干预后，SAMP8小鼠紧密连接结构较为正常，排列较有序，血管基底膜变薄，结构层次清晰；电针组和针药组海马区紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5和Occludin mRNA表达都有所增加，从而恢复血脑屏障结构稳定；与药物组相比，针药组海马区AChE含量明显降低，提示电针对SAMP8小鼠血脑屏障的调控，能够增强药物入脑。

目前很少关于电针对AD模型鼠血脑屏障的研究。Jung等[27]用电针对缺血性脑卒中模型小鼠进行预处理，可显著减轻血脑屏障破坏，增加紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-5的表达。孔海龙等[28]采用针药联用的方法，发现针药组AChE的含量明显降低。我们推测，电针可以改善模型鼠血脑屏障紊乱的结构，同时加强药物在脑中含量。其具体机制需要进一步深入研究。