柳维林，郑薏，金婷婷，张宇豪，施丹，陈立典，陶静

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是一群能够自我更新并具多向分化潜能的细胞，它主要分布在海马齿状回、脑室管膜下区，在适当条件下可分化成神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。有研究发现，在缺氧缺血情况下，海马齿状回和室管膜下区(subventricular zone,SVZ)等部位的内源性神经干细胞可增殖、迁移并分化成神经元和神经胶质细胞，这提示内源性神经干细胞参与中枢神经损伤的修复[1]。但脑缺血后可诱导反应性的星形胶质细胞重新表达巢蛋白(Nestin)和神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)，提示脑缺血损伤的修复机制可能与其密切相关，同时也可作为中枢神经系统损伤时的敏感指标之一[2]。近年来有研究认为，Nestin+/GFAP+细胞是神经干细胞或胶质前体细胞，在脑缺血后Nestin反应性表达可能是神经干细胞分化而来，也可能是脑缺血后具有分化潜能的神经胶质前体细胞[3-4]。Shimada等[5]在GFAP+/+转基因大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)小鼠模型中发现，Nestin+/GFAP+细胞显著增加，通过对其原代培养，发现这种细胞能够分化为神经元、胶质细胞。

近期研究报道，电针能促进缺血再灌注大鼠SVZ和海马齿状回Nestin+细胞、GFAP+细胞增殖和分化，从而促进神经再生，改善功能恢复[6-7]。已有许多研究证实，神经干细胞增殖分化受到microRNAs(miRNAs)的调控[8]。miRNAs是一种内源性非编码RNA(由18～23个核苷酸组成)，能够与特定mRNA3'UTR不完全或完全互补结合，抑制靶mRNA的翻译或促使其降解，从而参与调控细胞增殖、分化、代谢和凋亡等生物学过程。microRNA-34a(miR-34a)在大脑中有特异性表达，是miR-34家族的一员，越来越多的证据表明，在细胞分化的过程中，miR-34a起到非常重要的调控作用[9-10]。

本文试图阐明电针曲池和足三里是否是通过调控miR-34a促进脑缺血再灌注损伤大鼠缺血周边区神经干细胞分化为星形胶质细胞，从而为电针治疗脑卒中提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性Sprague-Dawley大鼠124只，16周龄，体质量250～275 g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，许可号SCXK(沪)2014-002。由福建中医药大学实验动物中心饲养，许可号SYXK(闽)2014-001。实验过程所有动物相关的处理严格按照国际动物伦理准则和使用指南的相关规定。

1.2 主要实验试剂

Nestin单抗、GFAP单抗、5-溴代-2'-脱氧尿苷(5-bromo-2´-deoxyuridine,BrdU)多抗：ABCAM公司。βactin多抗、碱性磷酸酶标记山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗：美国CST公司。miR-34a引物、逆转录实时定量聚合酶链反应(reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)试剂盒：广州复能基因公司。

1.3 实验分组及干预

将108只大鼠根据随机数字表法分为假手术组、模型组和电针组，每组36只，每组再分为3 d、7 d和14 d 3个时间点，每个时间点12只。另外16只大鼠根据随机数字表法分为电针+miR-34a抑制剂组和电针+二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)组，每组8只。DMSO为miR-34a的溶解液，设立电针+DMSO组作为电针+miR-34a抑制剂组的对照组。

电针组在造模后第2天取患侧肢体曲池(LⅠ11：桡骨近端的关节外侧前方的凹陷中)、足三里(ST36：膝关节后外侧，在腓骨小头下约5 mm处)，穴位定位参考《实验针灸学》[11]。局部消毒后，用华佗牌30号0.5寸毫针，针刺深度2～3 mm，接G6805型电针仪，电压峰值6 V，以大鼠肢体轻轻抖动为度，选用疏密波1/20 Hz，每次30 min，每天1次，共14 d。同时，造模后第2天至第14天各组进行腹腔注射BrdU，每天2次，每次注射间隔8 h。DMSO溶解液、miR-34a抑制剂在造模前进行侧脑室注射。

1.4 造模

实验大鼠术前24 h禁食，不禁水。采用改良Longa法[12]制备局灶性脑缺血动物模型。手术过程采用1.5%异氟烷气体麻醉。大鼠先处于俯卧，矢状位剪开额顶部皮肤约2 cm，暴露皮下筋膜，用浸满双氧水的棉签摩擦暴露的筋膜，直至暴露出颅骨前囟及左侧半颅骨。将激光多普勒血流仪的探头固定于前囟向左5 mm、向后3 mm定位点上，开始记录左侧大脑中动脉供血区域血流变化值，当所示数值平稳，开始制作MCAO模型。

将大鼠轻放至仰卧位(注意探针)并固定，取颈部正中开口1.5～2 cm，暴露分离颈总动脉(common carotid artery,CCA)、颈外动脉(external carotid artery,ECA)、 颈 内 动 脉 (internal carotid artery,ⅠCA)。 结 扎CCA近心端及ECA，用微动脉夹夹闭远端ⅠCA，在距CCA分叉处1.0 cm处用显微剪刀剪一切口，采用直径为0.2 mm尼龙线，头端涂上硅胶，使顶端直径约为0.22～0.25 mm，自左侧CCA插入ⅠCA至有少许阻力为止(自ECA与ⅠCA分叉处起计算插入约18～22 mm)，线栓到达大脑中动脉分支处，此时激光多普勒血流仪显示血流下降至基础值的20%～30%[13]，即为栓塞成功，再固定线栓，颈部伤口缝合。待缺血2 h后回抽线栓至CCA分叉处，恢复再灌注，此时MCAO模型制备完成。

假手术组只分离CCA、ⅠCA和ECA，但不结扎、插线，稍后缝合伤口。手术结束后，所有动物放置于25℃室温环境下苏醒，保持正常饮水、饮食，直到动物恢复活动。

1.5 神经功能缺损评估

采用Longa评分评价神经功能缺损[14]，电针前、电针后3 d、7 d和14 d，对假手术组、模型组和电针组进行神经症状评分，评分0～4分。

1.6 CatWalk动物步态分析

假手术组、模型组和电针组大鼠造模前，首先进行CatWalk适应性训练1周。训练合格标准[15]：大鼠连续不停顿地成功通过通道至少3次，由于大鼠造模后急性损伤严重，无法进行测试，因此只在造模前3 d记录其基线数据。大鼠在干预3 d、7 d和14 d后，三组均接受CatWalk系统步态分析检测，计算患侧右前爪和右后爪的爪印面积和压强。

1.7 免疫荧光染色

采用免疫荧光染色观察BrdU、Nestin与GFAP的共定位情况。大鼠在造模后14 d后，3%异氟烷麻醉，PBS和4%多聚甲醛灌流，每组取大鼠4只，取全脑组织，放入4%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋；5μm石蜡切片，脱蜡，透明；抗原修复和DNA变性，封闭；滴加一抗(Nestin，1∶150；GFAP，1∶500；BrdU，1∶500)，置湿盒中4℃孵育过夜，PBS冲洗；滴加FⅠTC标记的相应二抗(1∶500)，37℃避光孵育2 h，PBS冲洗；DAPⅠ复染；抗荧光淬灭处理及封片观察。在400×荧光显微镜下选取不重叠的6个视野，进行数据统计分析。

1.8 miR-34a表达检测

采用RT-qPCR检测缺血周边区miR-34a相对表达量。以U6 snRNA作为内参，检测电针干预7 d后各组大鼠缺血周围皮质区miR-34a在相对于表达量。每组取大鼠4只，取左侧缺血周边区脑组织提取总RNA，RNA逆转录，ABⅠ7500荧光定量PCR扩增miR-34a表达量。采用相对定量的方法表示表达量，即处理样本相对于未处理样本的倍数(2-△△Ct)。

当2-△△Ct＞1，目的基因表达上调，反之则下调。该实验重复3次，取平均值。

1.9 统计学分析

采用SPSS 18.0版软件进行统计处理，计量资料均以(±s)表示，两组间比较采用两独立样本t检验或Mann-Whitney U检验；多组均数间的比较采用One-Way ANOVA，进一步两两比较采用LSD法。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 Longa评分

各时间点假手术组的大鼠神经功能评分均正常。模型组和电针组在缺血再灌注24 h(电针干预前基线)明显出现不同程度神经功能缺损，但两组评分无显著性差异(P＞0.05)。而电针组3 d、7 d和14 d Longa评分低于模型组(P＜0.05)。见表1。

表1 各组Longa评分比较

2.2 CatWalk步态参数

模型组患侧肢体的爪印面积(右前爪、右后爪)、最大压强(右前爪、右后爪)与同时间假手术组比较均下降(P＜0.05)，模型组随着时间延长右后爪印面积增加(P＜0.05)。电针组患侧肢体的爪印面积(右前爪、右后爪)与同时间模型组比较增加(P＜0.05)。电针干预3 d和7 d后，电针组患侧最大压强(右前爪、右后爪)与模型组比较无显著性差异(P＞0.05)；14 d后电针组大于模型组(P＜0.05)。电针干预3 d至7 d，电针组右后爪印面积与右前最大压强逐渐增加，一定程度上呈时间依赖性(P＜0.05)。见表2～表5。

2.3 Nestin+/GFAP+细胞表达

随着缺血时间延长，Nestin+/GFAP+细胞在缺血周边区表达逐渐增多，在7 d达到高峰，14 d表达下降，但模型组各时间点比较无显著性差异(P＞0.05)。同时间点比较，电针组Nestin+/GFAP+细胞应激性表达均明显增加(P＜0.01)，且在7 d表达最多(P＜0.01)。见表6、图1。

2.4 BrdU+/GFAP+表达

缺血再灌注损伤后，模型组和电针组缺血周边区均有表达BrdU+与GFAP+细胞，且呈BrdU+/GFAP+双阳性共表达。但随着缺血时间延长，BrdU+/GFAP+细胞表达在7 d达到高峰，在14 d表达下降，但14 d与7 d相比无显著性差异(P＞0.05)。同时间点，电针组BrdU+/GFAP+双阳性细胞均明显多于模型组(P＜0.01)，且在7 d增加最多(P＜0.05)。见图2和表7。

表2 各组不同时间点右前爪爪印面积比较(cm2)

表3 各组不同时间点右前爪最大压强比较(a.u.)

表4 各组不同时间点右后爪爪印面积比较(cm2)

表5 各组不同时间点右右后爪最大压强比较(a.u.)

表6 各组缺血周围皮质区Nestin+/GFAP+细胞数量

2.5 miR-34a对BrdU+/GFAP+表达的影响

模型组、电针组和电针+DMSO溶剂组较假手术组miR-34a表达水平均明显升高(P＜0.01)，且电针组与电针+DMSO溶剂组相比无显著性差异(P＞0.05)，而电针+miR-34a抑制剂组较电针组降低(P＜0.05)。模型组缺血7 d后BrdU+/GFAP+细胞增加，电针组BrdU+/GFAP+细胞进一步增加，而电针+miR-34a抑制剂组较电针+DMSO组BrdU+/GFAP+细胞降低(P＜0.05)，电针+DMSO组与电针组比较无显著性差异(P＞0.05)。此外，在免疫荧光实验中无二抗阴性对照组没有表达。见表8、表9和图3。

表7 各组缺血周围皮质区Brd U+/GFAP+细胞数量

3 讨论

针刺是传统中医疗法的重要组成之一，在亚洲及西方国家已被共同认为可作为治疗脑卒中的辅助疗法。《素问•痿论篇》有曰：“治痿独取阳明”。阳明经为多气多血之经，又主润宗筋，“阳明虚则宗筋纵，宗筋纵则不能束筋骨以流利机关”。故阳明经穴对于脑卒中之肢体痿痹的治疗尤为适宜，而曲池和足三里均为阳明经之穴。

曲池：曲，屈曲。属手阳明大肠经之合穴，出自《灵枢•本输》。曲池穴功善调和气血，疏通经络等作用。曲池穴历代文献研究中与脑卒中联系密切，《针灸大全》：“中风偏枯，痛疼无时。……曲池二穴……”。《景岳全书》：“灸手足不遂、偏枯等证：曲池、足三里等穴。”

图2 各组Brd U+/GFAP+免疫荧光双标情况(免疫荧光染色，×200)

表8 各组大鼠缺血周围皮质区miR-34a相对表达量

表9 各组缺血周围皮质区Brd U+/GFAP+细胞数量

足三里始载于《内经》，治疗脑卒中，历代医家多有记载。《太平圣惠方》记载：“凡人未中风时，一两月前，或三五个月前，非时，足胫上忽发酸重顽痹，良久方解，此乃将中风之候也，便须急灸三里穴与绝骨穴。”《卫生宝鉴》亦有云：“凡觉手足麻痹或疼痛，良久乃已，此将中腑之候，宜灸此七穴(百会、发际、肩髑、曲池、风市、足三里、绝骨)凡觉心中愦乱，神思不怡，或手足麻痹，此中脏之候也。不问是风与气，可连灸此七穴(百会、大椎、风池、肩井、曲池、足三里、间使)”。

故选取手足阳明经曲池和足三里二穴组合具有疏通经络，调理气血阴阳平衡，扶正祛邪，则使脑卒中后机体功能得到最大限度的恢复。同时，已有大量文献证实，针灸可有效治疗脑卒中后运动功能障碍，临床上电针曲池和足三里两穴组合治疗软瘫期和恢复期的脑卒中患者能有效改善运动功能、肌张力、Fugl-Meyer评定量表评分和改良Ashworth量表评分[16]。已有研究证实，电针脑缺血再灌注损伤大鼠足三里和曲池可促进神经功能缺损恢复等神经保护作用[17-18]。但其具体作用机制尚未完全清楚。

当中枢神经系统受到损伤后，如缺血性脑卒中，神经干细胞被激活进入增殖分化阶段，通过不对称的分裂转变为神经前体细胞，然后迁移到达特定区域并分化成神经细胞，提示新生的神经细胞可能为脑缺血后机体功能的恢复提供机制[19-20]。脑缺血后缺血侧海马齿状回、SVZ以及缺血周边区均发现神经干细胞的增殖[21]，因此我们把缺血周边区作为观察神经干细胞的区域。

图3 各组7 d时Brd U+/GFAP+免疫荧光双标情况(免疫荧光染色，×200)

根据不同的特异性分子标记物和形态学，神经干细胞可表达Nestin和GFAP[22]。Shimada等[23]认为，Nestin+/GFAP+细胞是神经干细胞或神经前体细胞，发现在缺血周围区Nestin+/GFAP+细胞增加，并在体内和体外证实这种细胞能够分化为神经元、神经胶质细胞。Shen等[24]和Liu等[25]研究也都发现，MCAO大鼠在脑缺血后，缺血周围区Nestin+/GFAP+共定位细胞表达，且在7 d开始表达开始增加。本实验结果也证实，缺血再灌注损伤大鼠急性期缺血皮质周围区有大量的Nestin+/GFAP+细胞增殖，且在缺血后7 d表达达到高峰，14 d后逐渐下降，这与Fang等[26]的实验结果一致。

BrdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，它能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子，用于准备标记细胞增殖情况[27]。本研究观察到，缺血周边区BrdU+/GFAP+细胞在缺血周边区表达逐渐增多，在7 d达到高峰，14 d后逐渐下降，这与先前的研究[28]一致。但有学者发现[29]，在缺血海马齿状回区的GFAP+细胞表达随着缺血的时间增加，表达逐渐增多，在14 d阳性细胞表达最多，在21 d表达开始下降，说明GFAP的表达量与大脑缺血部位有关。

在体外小鼠胚胎干细胞实验研究中，过表达miR-34a可通过调控SⅠRT1表达促进小鼠胚胎干细胞的分化[30]。通过体外培养ⅠCR胎鼠脑皮质的神经干细胞实验发现，过表达的miR-34a可使Nestin蛋白表达量和基因的转录水平下降，说明miR-34a参与神经干细胞的增殖分化可能是通过调控Nestin表达来介导[31]。此外，miR-34a调控神经干细胞的分化扮演着重要的角色，过表达miR-34a可靶向作用于Syt1和Atg9a参与神经干细胞的分化调控[32]。值得注意的是，Aranha等[33]研究发现，在神经干细胞的分化过程中，miR-34a的表达伴随着星形胶质细胞的出现，并且在特定的条件下miR-34a过表达会促进GFAP+细胞的表达显著增加，从而认为miR-34a可能参与神经干细胞分化为星形胶质细胞的过程。

本研究发现，脑缺血后7 d，大鼠缺血周边区miR-34a表达相对模型组升高，而在电针干预后，miR-34a的表达进一步上调，与BrdU+/GFAP+细胞数量增加一致，提示电针能够促进缺血再灌注损伤大鼠miR-34a过表达促进神经干细胞分化。已有研究证实，miR-34a调控神经干细胞增殖分化，且可能参与神经干细胞分化为星形胶质细胞的过程[32-33]。因此，本实验为进一步明确电针是否特异性通过调控miR-34a促进神经干细胞分化，利用miR-34a抑制剂侧脑室干预后发现miR-34a抑制剂相对DMSO溶剂，能够阻断电针促进神经干细胞分化的效应，即缺血周边区BrdU+/GFAP+细胞数量减少，这些充分表明电针通过调控miR-34a过表达促进神经干细胞分化致BrdU+/GFAP+细胞数量增加。

本研究结果提示，miR-34a可能参与调控电针曲池和足三里促进缺血周边区Nestin+/GFAP+细胞增殖，且可能促进其分化为星形胶质细胞(BrdU+/GFAP+细胞)。但是miR-34a作用的靶基因信号分子的具体机制还有待进一步研究。