黄旭晴 蒋育悦 徐长青 郁东伟 王燕

急性肺损伤（ALI）常由实质性肺部感染或肺部出血引发，是以肺泡毛细血管膜受损为特征的异质性疾病，临床主要表现为进行性呼吸困难和顽固性低氧血症[1]。全身性损伤如创伤、败血症和急性肾损伤等也会引发ALI[2-3]。ALI的主要病理特征为肺内失控性炎症反应，如大量中性粒细胞浸润、肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，弥漫性肺间质及肺泡水肿。抗微生物治疗和支持治疗等对ALI有一定的效果，但ALI病死率仍高达30%～40%[4]，因此，研发ALI其他有效的治疗药物意义重大。ALI早期，在肺部出现明显纤维组织增生的同时存在肺部微血管增多[5]，大多数组织的损伤修复都伴随着微血管的改变。基于此，本研究旨在探讨血管内皮生长因子受体抑制剂Z-3-[（2,4-二甲基吡咯-5-烃基）亚甲基]-2-吲哚满酮（SU5416）在小鼠ALI中的作用及其可能的作用机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 30只SPF级雄性C57BL/6小鼠（体重18～22g）购自北京维通利华实验动物技术有限公司。脂多糖（LPS）购自美国Sigma公司。地塞米松购自百正药业股份有限公司。SU5416购自美国Sigma公司。超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧簇（ROS）检测试剂盒和 IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA试剂盒购自碧云天生物技术公司。人单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。B淋巴细胞瘤-2基因（bcl-2）、Toll样受体 4（TLR4）、血管内皮生长因子（VEGF）、VEGF 受体 2（VEGFR2）、NF-κB、磷酸化 NF-κB（pNF-κB）购自安诺论公司。β-actin抗体购自武汉博士德公司。电泳仪电源、垂直电泳槽、电转仪为北京六一仪器厂产品。正置光学显微镜为奥林巴斯公司产品。JEM-2100透射电子显微镜为日本电子公司产品。Abbott CD1700全自动动物血液细胞分析仪为迈瑞生物医疗电子股份有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠ALI模型制备与分组 将30只小鼠按随机数字表法分为模型组、SU5416组、地塞米松组、SU5416+地塞米松组、空白对照组，各6只。小鼠以异氟醚麻醉。LPS用0.9%氯化钠溶液溶解后，模型组、SU5416组、地塞米松组、SU5416+地塞米松组小鼠按5mg/kg的剂量滴鼻处理（均约0.5ml），空白对照组小鼠滴入等体积0.9%氯化钠溶液。SU5416组小鼠在LPS处理1h后按20 mg/kg的剂量给予SU5416[以二甲基亚砜(DMSO）为溶媒]灌胃，地塞米松组小鼠按5mg/kg的剂量给予地塞米松（以DMSO为溶媒）灌胃，SU5416+地塞米松组小鼠按上述方法同时给予SU5416和地塞米松灌胃，空白对照组和模型组以等体积的含有DMSO的0.9%氯化钠溶液灌胃。

1.2.2 支气管肺泡灌洗液（BALF）中性粒细胞、淋巴细胞计数 各组小鼠灌胃干预24h后，使用40mg/kg剂量的戊巴比妥钠麻醉；开胸，分离气管，在气管下穿一丝线，分离右主支气管并用丝线结扎；于气管环处剪一V型切口，插入直径约2mm的无菌塑料管，丝线结扎固定，以4℃无菌0.9%氯化钠注射液灌洗左肺（5ml×3次），反复抽吸3次，收集BALF于无菌瓶中。用Abbott CD1700全自动血细胞分析仪检测各组小鼠BALF中性粒细胞和淋巴细胞数目。

1.2.3 肺组织SOD、ROS活性检测 取各小鼠部分肺组织，4℃匀浆器进行匀浆，约12 000rpm，离心5min，提取上清液。参照SOD、ROS检测试剂盒说明书方法进行检测，并按照公式分别计算出SOD与ROS活性。

1.2.4 肺组织炎症因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 水平检测 采用ELISA法，取各小鼠部分肺组织，4℃匀浆器进行匀浆，约12 000rpm，离心5min，取上清液用于检测 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 水平，操作参照ELISA试剂盒说明书进行。

1.2.5 bcl-2、TLR4、VEGF、NF-κB 蛋白水平检测 采用Western blot法。取部分肺组织匀浆液，加5×蛋白上样缓冲液后煮沸5min。制备10%SDS-PAGE胶，按40μg蛋白量上样；120V电泳1.5h；350mA转膜50min；5%脱脂奶粉溶液封闭 2h，按比例加入 bcl-2、TLR4、VEGF、VEGF2、NF-κB、pNF-κB 一抗后 4℃过夜；TBST 洗涤后加入二抗，作用2h；TBST洗膜后ECL显像，以β-actin为内参，采用Image J软件分析各蛋白条带灰度值。

1.2.6 肺组织病理形态观察 取小鼠部分肺组织用10%甲醛固定、酒精脱水、石蜡包埋、连续切片、HE染色，光学显微镜200倍视野下观察肺组织病理形态。另取小鼠部分肺组织，切成1mm3左右的组织块，戊二醛溶液固定，经漂洗、固定、脱水、渗透、包埋、制片，用透射电子显微镜观察肺组织超微结构的变化。

1.3 观察指标 观察并比较5组小鼠（1）BALF中性粒细胞、淋巴细胞计数；（2）肺组织 SOD、ROS 活性；（3）肺组织炎症因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 水平；（4）肺组织 bcl-2、TLR4、VEGF、VEGFR2、NF-κB、pNF-κB 蛋白水平；（5）肺组织病理形态。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件；计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5组小鼠BALF中性粒细胞、淋巴细胞计数比较见表1。

表1 5组小鼠BALF中性粒细胞、淋巴细胞计数比较（×104个）

由表1可见，5组小鼠BALF中性粒细胞、淋巴细胞计数比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；两两比较，除SU5416组与地塞米松组外，其余组间比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。即模型组小鼠BALF中性粒细胞、淋巴细胞明显增多，说明小鼠ALI模型制备成功。SU5416与地塞米松均能抑制LPS刺激导致的ALI，两者之间没有明显差异，但两者联用的抑制作用明显强于其中一种单独使用。

2.2 5组小鼠肺组织SOD、ROS活性比较 见表2。

表2 5组小鼠肺组织SOD、ROS活性比较

由表2可见，5组小鼠肺组织SOD、ROS活性比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；两两比较，除SU5416组与地塞米松组小鼠肺组织SOD活性外，其余组间肺组织SOD、ROS活性比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。即模型组小鼠肺组织SOD活性明显下降，ROS活性明显上升；SU5416与地塞米松都能明显逆转这种改变，对SOD活性的改变，两者没有明显差异，而地塞米松对ROS活性的改变更明显，两者联用的逆转改变明显强于其中一种单独使用。

2.3 5 组小鼠肺组织炎症因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1水平比较 见表3。

表3 5组小鼠肺组织炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1水平比较（pg/mgprot）

由表3可见，5组小鼠肺组织炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；两两比较，除SU5416组与地塞米松组外，其余组间比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。模型组小鼠肺组织炎症因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 水平均明显上升，SU5416和地塞米松都能明显逆转这种改变，两者之间没有明显差异，但两者联用的逆转改变明显强于其中一种单独使用。

2.4 5 组小鼠肺组织 bcl-2、TLR4、VEGF、VEGFR2、NF-κB、pNF-κB蛋白水平比较 见图1、表4。

由图1、表4可见，5组小鼠肺组织bcl-2、TLR4、VEGF、NF-κB蛋白水平比较差异均有统计学差异（均P＜0.05）。即模型组小鼠肺组织在LPS刺激下抗凋亡蛋白 bcl-2 的表达下调，TLR4、VEGR、VEGFR2 和 pNF-κB的表达上调；SU5416与地塞米松均能明显逆转这些改变；与模型组比较，地塞米松组小鼠肺组织TLR4、VEGF的表达无统计学差异，而VEGFR2、pNF-κB表达明显下调，抗凋亡蛋白bcl-2表达明显上调。SU5416与地塞米松两者联用的逆转改变明显强于其中一种单独使用。

图 1 5 组小鼠肺组织 bcl-2、TLR4、VEGF、VEGFR2、NF-κB、pNF-κB蛋白电泳图

2.5 5组小鼠肺组织病理形态比较 见图2。

由图2可见，光学显微镜下可见空白对照组小鼠肺泡结构正常，无充血，肺泡间隔正常，个别区域可见少量炎症细胞浸润；模型组小鼠可见明显的肺泡炎症表现，肺泡结构破坏，肺泡腔内可见水肿液，肺泡毛细血管充血、肺泡间隔厚度增加，并出现大量炎症细胞浸润；与模型组相比，SU5416组、地塞米松组小鼠肺泡间隔减小，炎症细胞浸润减轻，肺泡结构破坏减轻。SU5416+地塞米松组上述情况进一步减轻，接近正常。

电子显微镜下可见空白对照组小鼠肺泡上皮细胞形态和肺泡毛细血管膜结构基本正常。模型组小鼠肺泡上皮细胞细胞器减少，肺泡毛细血管内皮剥脱，肺泡壁严重破坏、坏死，肺泡间的间隔增宽，出现弥漫性的水肿，肺泡腔萎陷。与模型组相比，SU5416组、地塞米松组小鼠肺泡上皮细胞细胞器增多，肺泡毛细血管内皮少见剥脱，肺泡间的间隔缩小，水肿的肺泡萎陷程度减轻。SU5416+地塞米松组肺泡上皮细胞形态和肺泡毛细血管膜结构接近正常。

表 4 5 组小鼠肺组织 bcl-2、TLR4、VEGF、VEGFR2、NF-κB、pNF-κB 蛋白水平比较

图2 5组小鼠肺组织病理形态比较（a：光学显微镜下所见，HE染色，×200；b：电子显微镜下所见，×10 000）

3 讨论

本研究结果提示，LPS所致小鼠BALF中性粒细胞、淋巴细胞数目的改变，肺组织SOD、ROS活性，炎症因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 水平，以及病理形态的改变说明小鼠ALI模型制备成功。地塞米松干预ALI在炎症细胞沉积、炎症介质释放及肺水肿等方面均可发挥积极的作用。研究发现，低剂量地塞米松较高剂量更能改善肺炎症介质的释放[6]。因此本研究采用低剂量地塞米松干预作为阳性对照。

氧化应激由机体内氧化和抗氧化系统失衡导致，这两大系统于机体内既相互制约又相互依存。ROS属于氧化系统，而SOD属于抗氧化系统。近年来，在ALI的机制研究中发现，氧化应激在ALI的病理发展过程中扮演重要角色[7]。抗氧化剂治疗已经成为一些肺脏疾病的一种新方向，如N-乙酰半胱氨酸在临床上表现出对ALI一定的治疗效果[8-9]。本研究结果显示，SU5416与地塞米松均能够明显抑制ROS活性，提高SOD的活性，减轻氧化应激，两者联合干预比单独干预效果更好。

ALI是全身性炎症之于肺部的具体表现，它的病理生理特点主要为中性粒细胞大量聚集导致炎症持续存在[10]。ALI时肺泡巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞激活，同时释放多种炎症因子如 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1等，引起肺以及免疫系统的功能失调。中性粒细胞在炎症的初始阶段即参与其发生、发展，中性粒细胞的过度活化或持续存在会大量破坏基底膜，最终增强肺泡毛细血管通透性[11]。淋巴细胞在ALI的炎症反应过程中也起着重要的调控作用[12]。TLR4是LPS受体，其作用是识别侵入体内的革兰阴性细菌并启动炎症反应。TLR4激活将引起一系列下游分子的活化，并活化通用转录因子 NF-κB、AP-I等最终引起以 TNF-α、IL-1 等为中心的促炎症因子激活，放大炎症效应。本研究发现，SU5416与地塞米松均能够减轻肺组织的炎症反应，抑制 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 的表达，两者联用具有更好的效果。

血管活性物质和血管相关生长因子在ALI的发展中亦起重要作用[12-13]。VEGF是目前已知最强的血管渗透剂，在肺组织高表达，除此之外在肺泡Ⅱ型上皮细胞、间质细胞、活化的肺泡巨噬细胞和中性粒细胞中也都有表达。在病理情况下，肺泡上皮屏障被破坏，血管内皮细胞直接暴露于高浓度的VEGF，血管通透性增加，导致非心源性肺水肿[14]。VEGF作用机制就是与VEGFR结合，增加一氧化氮的释放，刺激前列环素的产生，增加血管通透性[15]。且炎症因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等均能诱导VEGF的表达，TLR4-NF-κB信号传导通路也能够介导VEGF的表达[16]。本研究结果显示，SU5416能够有效抑制VEGF和VEGFR的表达，此外SU5416能抑制TLR4表达，提高pNF-κB的表达。而地塞米松对于VEGF、TLR4没有调控作用，说明地塞米松不是通过调控VEGF、TLR4途径来发挥作用的。

细胞凋亡在ALI/急性呼吸窘迫综合征（ALI/ARDS）发病中起至关重要的作用。在ALI/ARDS的发病中存在两个重要的细胞凋亡相关机制。ROS又是细胞凋亡的重要媒介之一，可作为第二信使触发凋亡信号途径，如增加线粒体膜通透性转换孔（mPTP）通透性，释放CytC入细胞质，促凋亡因子释放，最终导致细胞凋亡。因此不难想到，凋亡在ALI中会发挥重要作用[17]。本研究检测了抗凋亡蛋白bcl-2的表达水平。SU5416和地塞米松均能上调bcl-2的表达，抑制凋亡。

综上所述，SU5416对小鼠ALI具有保护作用，其作用机制可能是通过减轻炎症反应、氧化应激以及调控TLR4/VEGF/NF-κB信号通路实现。