何东元 郑志贵 陈宜方 陈建国

糖尿病肾病是终末期肾病患者的首要病因，而足细胞损伤是糖尿病肾病发生、发展的关键环节[1]。既往研究显示，糖尿病患者早期就可出现足细胞黏附功能下降，足细胞脱落，导致肾小球基底膜裸露，加速糖尿病肾病进展[2]。粘着斑激酶（FAK）在细胞黏附和迁移中发挥重要作用，若缺乏FAK，细胞迁移能力会出现显著降低，且FAK磷酸化可改变细胞的黏附能力[3]。有不少研究显示，传统中药黄芪的重要活性成分黄芪甲苷（AS-IV）对足细胞具有保护作用[4-6]，但作用机制尚未完全阐明。基于此，本研究旨在观察AS-IV对高糖环境下足细胞黏附能力的影响，并探讨其作用机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 条件永生化小鼠足细胞（浙江医院实验室）；AS-IV 单体（TLC纯度 98%）、D-葡萄糖和 γ-IFN（美国Sigma公司）；FBS、青霉素、链霉素和RPMI 1640培养液（美国Gibco公司）；抗FAK抗体、抗磷酸化FAK（p-FAK）抗体、抗GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗和ECL化学发光剂（美国Santa Cruz公司）；RAPA蛋白裂解缓冲液（中国上海联硕生物科技有限公司）；BCA试剂盒（美国Pierce公司）；Transwell-Col PTFE过滤器（3μm孔，美国Corning公司）；细胞黏附荧光定量试剂盒（美国Calbiochem公司）；Bio-Rad 2000凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；FlexStation 3荧光读板仪（美国Molecular Devices公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组 条件永生化小鼠足细胞生长在RPMI 1640培养液（含10%FBS、100U/ml青霉素和100mg/L链霉素）中。在33℃、10U/ml γ-IFN条件下传代，在37℃、无γ-IFN条件下诱导分化。分化后的足细胞用1%FBS培养液培养24h同步化后分为以下4组。正常对照组（Con组）：D-葡萄糖 5mmol/L；高糖组（HG组）：D-葡萄糖30mmol/L；高糖+低剂量AS-IV组（HG+LD 组）：D-葡萄糖 30mmol/L+AS-IV 50mg/L；高糖+高剂量AS-IV组（HG+HD组）：D-葡萄糖30mmol/L+ASIV 100mg/L。

1.2.2 足细胞黏附能力测定 使用细胞黏附荧光定量试剂盒检测足细胞黏附能力。分化的足细胞种植在分别铺有基底膜复合物（BMC）、小牛血清白蛋白（阴性对照）和多聚赖氨酸（阳性对照）的96孔培养板中，按上述分组进行干预。各组于干预3、6、12和24h后分别随机选取24孔弃去培养液，每孔200μl PBS冲洗2次除去未黏附的细胞，每孔加入100μl荧光Calcein-A M工作液，37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育1h，荧光读板仪（FlexStation 384）上检测每孔相对荧光强度（RFU），激发波长485 nm、发射波长520 nm。RFU值越大，说明黏附的细胞数量越多，细胞黏附能力越强。

1.2.3 白蛋白流量率检测法测定足细胞单层屏障功能（单层渗漏白蛋白浓度） 5×105个分化的足细胞接种于Ⅰ型胶原包被Transwell上室（3μm孔），不同条件下培养48h。丢弃培养液，用含1mmol/L CaCl2和1mmol/L MgCl2的PBS洗2次。然后，上室填充0.15ml的RPMI 1640，底腔填充1ml含40mg/ml小牛血清白蛋白的RPMI 1640培养液37℃孵育6h。BCA试剂盒检测上室培养液白蛋白浓度。

1.2.4 Western blot法检测FAK与p-FAK表达 各组细胞干预24、48h后，蛋白裂解液裂解各组细胞，10%SDS-PAGE凝胶电泳分离，2%小牛血清白蛋白的TBST室温封闭60min，加入抗FAK、抗p-FAK和抗GAPDH抗体4℃孵育24h，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育60min，ECL发光剂在X线片上曝光显影。Bio-Rad 2000凝胶成像系统扫描光密度。实验重复3次，得出目的蛋白与GAPDH光密度比值作为目的蛋白表达水平。

1.3 观察指标 观察并比较（1）4组足细胞黏附能力；（2）4组足细胞单层屏障功能；（3）4组足细胞FAK与p-FAK表达情况。

1.4 统计学处理 应用SigmaStat 12.0统计软件；计量资料以 表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组足细胞黏附能力比较 见图1。

图1 4组足细胞黏附能力比较

由图1可见，干预12h后，4组足细胞黏附能力比较差异有统计学意义（P＜0.05），干预 3、6、12、24h 后，Con、HG、HG+HD组足细胞黏附能力比较差异亦均有统计学意义（均P＜0.05）。即高糖环境会降低足细胞的黏附能力，而AS-IV可明显增强高糖环境下足细胞的黏附能力，且该作用具有时间和剂量依赖性。

2.2 4组足细胞单层屏障功能比较 见图2。

图2 4组足细胞单层屏障功能比较

由图2可见，4组足细胞单层屏障功能比较差异有统计学意义（P＜0.05）。即高糖环境会降低足细胞单层屏障功能，而AS-IV可剂量依赖性地增强高糖环境下足细胞单层屏障功能。

2.3 4组足细胞FAK与p-FAK表达情况比较 见图3。

图3 4组足细胞FAK与p-FAK表达情况比较

由图3可见，干预24、48h后，4组足细胞FAK表达情况比较均无统计学差异（均P＞0.05），p-FAK表达情况比较均有统计学差异（均P＜0.05）。即高糖环境对足细胞FAK表达无明显影响，但会明显增加FAK磷酸化；AS-IV可明显抑制高糖环境下足细胞FAK蛋白磷酸化，且该作用具有时间和剂量依赖性。

3 讨论

祖国传统医学认为黄芪具有补气升阳、益卫固表、利水消肿等功效。黄芪用于治疗糖尿病和肾脏疾病已有上千年的历史[4]。AS-IV是黄芪主要活性成分，具有调节免疫、抗炎症因子、抗间质纤维化、抗凋亡和抗氧化应激等多方面药理作用。AS-IV被2005版《中国药典》纳作评估黄芪药材质量的指标。既往研究显示，AS-IV可通过抑制PERK-ATF4-CHOP信号通路抑制高糖环境下足细胞凋亡[5]，抑制NF-κB改善糖尿病大鼠足细胞足突融合，降低蛋白尿[6]，但AS-IV对足细胞的保护作用机制尚未完全阐明。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分，足细胞数量减少和/或功能障碍与蛋白尿的发生、发展密切相关[7]。高糖环境下足细胞黏附能力减弱是足细胞从肾小球基底膜脱落的重要原因，也是早期糖尿病肾病进展的重要原因[1]。足细胞是终末分化细胞，几乎没有增殖能力[7]。足细胞脱落或坏死将导致足细胞数量不可逆性减少，基底膜裸露，肾小球壁层上皮细胞和裸露的基底膜粘连，最终导致肾小球硬化和肾脏功能衰竭[8]。研究显示，1型糖尿病和2型糖尿病早期均有足细胞脱落和数量减少现象[9]。减少足细胞脱落可能成为未来糖尿病肾病治疗的靶点。本研究采用细胞黏附荧光定量试剂盒检测足细胞和BMC之间的黏附能力，采用白蛋白流量率检测法检测足细胞单层屏障功能。结果显示，高糖环境下足细胞与BMC之间的黏附能力明显下降，足细胞单层屏障功能明显下降，而AS-IV干预可增强高糖环境下足细胞黏附能力，增强足细胞单层屏障功能，其作用具有时间和剂量依赖性。

FAK是一种非受体络氨酸激酶，在细胞黏附中起重要作用。目前认为FAK和β整合素直接相连，是整合素信号传导的中枢介质，也是其他细胞表面受体信号传递的重要组成部分[10]。FAK磷酸化是整合素、生长因子和细胞外基质蛋白启动的信号通路中的早期事件，FAK调节细胞迁移在许多类型细胞中已被证实。表皮伤口愈合过程中迁移的角质形成细胞FAK表达或激活增加，在体外培养的内皮细胞迁移过程中也观察到相同现象[11-12]。FAK在肾脏发育和细胞分化中起重要作用。FAK基因敲除的小鼠出现严重的中胚层缺陷，在胚胎早期死亡[13]。FAK沉默的成纤维细胞迁移能力严重缺陷[14]。抑制FAK磷酸化可导致成纤维细胞和内皮细胞迁移能力下降，过度表达FAK可导致多种细胞迁移能力增加[15]。既往研究显示，足细胞表达FAK，足细胞损伤后FAK磷酸化增加。FAK磷酸化后可以激活多个下游信号通路，其中FAK/p38 MAPK通路是重要的一条。p38 MAPK属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，在炎症、氧化应激、衰老、自噬以及细胞凋亡中均有重要作用[16]。FAK/p38 MAPK通路参与阿霉素[17]和转化生长因子β1诱导的足细胞损伤[18]。足细胞特异性敲除FAK基因或药物抑制FAK/p38 MAPK信号通路可缓解蛋白尿和足细胞足突融合[17，19]。本研究结果与既往研究结果相符，高糖环境对足细胞FAK表达无明显影响，但会明显增加FAK磷酸化；AS-IV可明显抑制高糖环境下足细胞FAK蛋白磷酸化，且该作用具有时间和剂量依赖性。

综上所述，AS-IV可能通过抑制FAK磷酸化改善高糖环境下足细胞的黏附能力。本研究结果或将为糖尿病肾病的早期治疗提供理论参考。