刘婉婷， 钱诗蕾， 袁小澎

南方医科大学珠江医院检验医学部(广东广州 510280)

1990—2010年间，全球慢性肾脏疾病(chronic kidney disease,CKD)死亡人数几乎翻了一番[1]。根据2013年的一篇报道，CKD在全球范围内的流行率达到8%～16%[2]。肾纤维化是各种类型CKD发展至终末期肾病的共同通路。肾纤维化的严重程度与肾功能减退具有密切的关系。因此，了解肾纤维化的发病机制有助于减缓和逆转CKD的进展过程，提高CKD患者的生存质量。近年来，表观遗传学已成为肾纤维化研究领域的一个热点问题。通过对表观遗传学的研究，有助于同行更深入地了解肾纤维化的发病机制，为今后对肾纤维化的靶向治疗提供新的思路。

1 肾纤维化与表观遗传学概述

肾纤维化的主要病理特征是肾小管破坏、成纤维细胞增殖活化以及细胞外基质蛋白(extracellular matrix, ECM)积聚。肾纤维化是多因素驱动的病理过程，包括炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、成纤维细胞活化以及上皮细胞向成纤维细胞转化等。肾纤维化的持续发展将促进肾脏器官结构进一步破坏，导致肾功能衰竭，最终严重威胁人类健康和生命。

学者们对肾纤维化机制的研究不仅仅限于这些病理过程，近年来众多研究还发现表观遗传学在肾纤维化的发病过程中扮演着极其重要的角色。表观遗传学是指在DNA序列不发生改变的前提下，基因表达发生了可遗传改变，同时引起表型的可遗传变化。表观遗传调控的方式主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA(MicroRNA，miRNA)修饰等。通常来说, DNA 甲基化、组蛋白和miRNA这三者的作用是相对独立的, 但是在某些情况下也会产生相互作用从而形成调节网络。除了肾脏之外，研究还发现表观遗传学在其他器官组织纤维化的发生发展过程中也起着一定的作用，比如肝脏、肺、心脏、小肠、皮肤[3]。

2 DNA甲基化与肾纤维化

2.1 DNA甲基化 DNA甲基化是指胞嘧啶环C5位置在DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferases，DNMTs)的催化作用下添加一个甲基，产生5-甲基胞嘧啶。DNMTs是调控DNA甲基化的关键酶。目前，在哺乳动物中已发现了DNMT蛋白家族的5个成员，分别是DNMT-1、DNMT-2、DNMT-3a、DNMT-3b和DNMT-3L，其中只有3个成员具有甲基转移酶的催化活性，分别是DNMT-1、DNMT-3a和DNMT-3b。它们在基因组中发挥特定的作用，比如，DNMT-1主要参与维持甲基化，而DNMT-3a和DNMT-3b在胚胎发育过程中负责从头甲基化。DNA甲基化水平主要由甲基化和去甲基化两个过程协同调控，进而动态影响基因表达的变化以及从发育到疾病的各个过程。

2.2 肾纤维化中的DNA甲基化修饰 Bechtel等[4]表明Rasal1(Ras GTPpase-activating like protein 1, Rasal1)基因甲基化是成纤维细胞持续增殖并造成肾纤维化的主要原因，通过叶酸诱导的小鼠肾纤维化模型发现DNMT-1表达增加，在使用脱甲基化试剂5-氮杂胞苷处理后减轻了肾纤维化的程度，从而证明了基因启动子异常甲基化参与了肾纤维化中的发展过程。此外，Tampe等[5]研究也发现5-氮杂胞苷能纠正启动子的异常甲基化使其发生脱甲基化，再次证明肾纤维化与Rasal1基因异常甲基化以及后续的转录抑制有关。基因启动子发生异常甲基化不仅仅驱动了肾纤维化的发生，研究还表明在小梁网组织纤维化[6]、肝纤维化[7]、肺纤维化[8]、心脏纤维化[9]和胃癌[10]的发展过程中，都有着不同程度的基因甲基化现象。总的来说，基因启动子异常甲基化参与了多种器官组织纤维化发生和癌症形成的过程。去甲基化试剂如5-氮杂胞苷[4-5]已经被证明在实验动物模型中能够起到治疗肾纤维化的作用，但是去甲基化试剂治疗也伴随着一定的细胞毒性，并且对全基因组去甲基化的长期影响是未知的，后续的相关实验可以适当延长实验周期并评估该试剂的毒理作用。

除了Rasal1基因之外，还有Klotho基因在肾纤维化中发挥着重要作用。Klotho是一种肾脏特异性抗衰老蛋白，具有保护肾脏和抗纤维化的功能[11]。研究通过miRNA干扰和药物阻断证实了Klotho基因在单侧输尿管结扎(unilateral ureteral ligation，UUO)诱导的肾纤维化中起着重要作用[12]。Zhang等[13]研究表明在纤维化肾脏中的Klotho表达缺失与DNMT-1和DNMT-3引起的Klotho启动子甲基化有关，大黄素通过影响这些表观遗传学改变从而抑制了肾纤维化，揭示了靶向Klotho表观遗传干预对肾纤维化疾病具有一定的治疗作用。

3 组蛋白修饰与肾纤维化

3.1 组蛋白修饰 在真核生物中，DNA与组蛋白包绕在一起。核心组蛋白通常由H2A、H2B、H3和H4组成。组蛋白修饰是指组蛋白在相关酶的作用下发生甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和腺苷酸化等修饰的过程。组蛋白修饰中最常见的形式是甲基化和乙酰化。组蛋白甲基化是由组蛋白甲基化转移酶来完成的，甲基化可发生在组蛋白的赖氨酸和精氨酸残基上，而且赖氨酸残基能够发生单甲基化、双甲基化和三甲基化，而精氨酸残基能够发生单甲基化和双甲基化。组蛋白乙酰化主要发生在H3、H4的N端赖氨酸位置上，是在组蛋白乙酰化酶(Histone deacetylases，HDACs)和组蛋白去乙酰化酶的协调作用下进行。相对而言，组蛋白甲基化修饰是最稳定的，而乙酰化修饰具有较高的动态，另外还有其他不稳定的修饰方式，如磷酸化、泛素化和腺苷酸化等，这些修饰更为灵活地影响染色质的结构与功能，从而发挥调控功能。

3.2 肾纤维化中的组蛋白修饰 组蛋白甲基化是通过组蛋白甲基转移酶使组蛋白的赖氨酸(K)或精氨酸(R)残基上发生甲基化，而组蛋白3尾(H3)中的第九赖氨酸(K9)特别易于修饰，组蛋白甲基化转移酶比如G9a是H3K9发生单甲基化和双甲基化的关键酶[14]。Irifuku等[15]研究发现G9a诱导的H3K9单甲基化在肾纤维化进展中具有重要作用，还发现H3K9单甲基化能调节Klotho启动子的活性，提示抑制G9a可作为治疗CKD的有效手段。组蛋白甲基化能被抑制剂所逆转，因此通过抑制组蛋白甲基化治疗肾纤维化具有广阔的研究前景。Sun等[16]研究表明在糖尿病肾病模型中，转化生长因子-β1(transforming growth factor beta, TGF-β1)能诱导ECM表达，伴随着H3K4单甲基化、H3K4双甲基化和H3K4三甲基化水平的升高，以及H3K9双甲基化、H3K9三甲基化水平的降低，该结果说明抑制组蛋白甲基化修饰起到保护肾脏的作用。此外，H3K9也可以发生乙酰化，Hewitson 等[17]研究为肾纤维化发展过程中H3K9修饰的动态变化提供了证据。目前，人们对组蛋白修饰的研究主要集中于对组蛋白去乙酰酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors，HDACIs)治疗效果方面的探索。在小鼠肾纤维化UUO模型中，HDACIs明显抑制了肾纤维化，表明组蛋白乙酰化和脱乙酰化修饰参与了肾纤维化的发展[18]。Choi等[19]发现白藜芦醇具有抗纤维化的作用，并且与HDAC4和HDAC5的下调有关，因此，白藜芦醇有可能是一种潜在的治疗药物。

尽管目前已经有很多关于HDACIs应用于肿瘤的临床试验报道，但还没有HDACIs用于治疗CKD患者的临床试验[20]。因此，在未来需要进一步研究HDACIs在CKD模型中的机制、功效和毒性，将有助于启动临床试验以评估HDACIs在治疗CKD中的可行性。

4 miRNA 修饰与肾纤维化

4.1 miRNA修饰 miRNA是一种短的非编码短核苷酸RNA，长度约为22 bp，起着转录后调节因子的作用[21]。miRNA常与内含子结合来调节基因表达[22],使细胞获得更为稳定的基因沉默，这种长时期的基因沉默可以通过细胞分裂得到遗传。因此，RNA沉默控制了许多相关功能基因的表达，成为一种调控基因结构和表达活性的机制。miRNA已经成为医学研究的重点方向，并被广泛应用于肿瘤及其他疾病的研究。

4.2 肾纤维化中的miRNA改变 很多研究证明miRNAs参与多种病理和生理过程，如器官形成[23]、胚胎发育[24]、肿瘤发生[25]和纤维化[26]。越来越多的研究发现提示miRNAs在肾脏疾病中的发生发展中发挥重要作用，比如miRNA-21[27]、miRNA-192[28]、miRNA-200a[29]和miRNA-433[30]。在糖尿病肾病中，miRNA通过转录后机制调节基因的表达[31]。Kölling等[32]研究发现，在糖尿病肾病小鼠模型中，体内和体外实验证明miR-21拮抗剂能减少系膜的扩张、间质纤维化、巨噬细胞的浸润和足细胞缺失，以及抑制纤维化和炎症基因的表达，此外，miR-21沉默显著提高了Alport小鼠的存活率并减轻了肾小球硬化、间质纤维化、小管损伤和炎症的程度[33]，以上均揭示了miR-21拮抗剂有可能是CKD包括糖尿病肾病和Alport肾病的一种潜在治疗方案。此外，miRNA与DNA甲基化和组蛋白修饰等可相互影响，从而在肾纤维化的发展中发挥作用。

5 展望

表观遗传学的出现让人们对遗传学和基因学之间的关系有了全新的思考。通过对肾纤维化的表观遗传学研究，可以让我们更清楚地了解到肾纤维化的发生、发展过程，但目前还有许多未解决的问题，比如，除了Rasal1和Klotho基因甲基化参与肾纤维化的发展之外，是否还有别的特定基因也参与其中需要科研工作者的不断探索；不同纤维化的器官组织之间是否存在共同的基因发生甲基化也需要深入的研究；去甲基化试剂是否能成为靶向治疗肾纤维化的有效策略也需要更多的临床试验去验证。目前，我们课题组已经在进行相关动物模型靶向基因甲基化的治疗实验，也取得了一定的结果，但是具体的作用机制还在探索当中。明确表观遗传修饰在肾纤维化发生中的具体作用机制，有助于为肾纤维化的预防、干预和治疗提供新的靶点和方向，同时为肾纤维化的临床治疗研究提供新的思路。