郭建强，李素娟，贾宇臣

（内蒙古医科大学附属医院 1.心内科，2.消化内科，内蒙古 呼和浩特 010050；3.内蒙古医科大学 分子生物学研究中心，内蒙古 呼和浩特 010050）

嗜铬粒蛋白A是一种酸性、亲水性分泌蛋白，分布于交感神经节后神经元及肾上腺髓质的嗜铬性颗粒内，与儿茶酚胺共同储存在分泌囊泡中[1]。儿茶酚胺抑素（Catestatin）是嗜铬粒蛋白A中含21个氨基酸残基的分泌片段，能以负反馈的形式抑制儿茶酚胺的释放，因此具有抑制交感神经活性的作用[2-3]，而交感神经系统激活是高血压重要的病理生理机制[4]。自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats,SHR）是研究高血压的理想模型[5]。本研究拟通过检测SHR不同发育阶段血浆Catestatin浓度的变化规律及给该大鼠尾静脉注射Catestatin后的心率变化，探讨Catestatin在高血压交感神经活化中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

无特定病原体（SPF）级雄性大鼠，购自北京维通利华公司，动物合格证号为11400700077784。SHR（SHR组）和正常血压大鼠（Wistar-Kyoto rats,WKY）（WKY组），每组7只，普通饲料喂养，自由进食。实验室恒温（22～24℃）、恒湿（相对湿度：60%），光亮自动切换（亮12 h，8：00～20：00；暗12 h，20：00～8：00）。本研究的动物实验方案由内蒙古医科大学伦理委员会审核通过。

1.2 材料、试剂与仪器

Catestatin多肽序列为RSMRLSFRARGYGFRDPG LQL，由北京赛百盛基因技术有限公司合成，BP-98AL智能无创血压测量仪由北京软隆生物技术有限公司提供，酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（美国Phoenix Pharmaceuticals公司）购自康肽生物科技（北京）有限公司，美国SpectraMax iD3多功能酶标仪，抑肽酶购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，货号A1153。

1.3 血压和心率的测量

采用尾套法检测两组6、12及16周龄大鼠的血压及心率。具体操作步骤根据BP-98AL产品说明书进行。将待测大鼠置于安静、温暖的环境中。适应30 min后将大鼠放在鼠袋中，保持恒温，然后将感应器置于大鼠的尾根部，按下开始键，BP-98AL自动监测大鼠尾部的血流脉动，当判定脉波稳定时，自动开始测量，从测压仪上读取收缩压、舒张压、平均动脉压和心率数据，连测5次，取其平均值。

给12周龄SHR尾静脉注射合成的Catestatin，剂量为3 μg/g体重。Catestatin注射剂量参考文献[6]，30 min后检测血压及心率，方法同前。

1.4 血浆Catestatin的检测

采用ELISA测定血浆Catestatin水平。分别在大鼠的6、12及16周龄时从眼眶静脉丛留取血标本0.3～0.4 ml，大鼠继续培养。血标本立即以 3 000 r/min，离心半径7.5 cm，离心10 min，分离血浆，加入10%EDTA-2Na（1 mg/ml）和抑肽酶 2 500 IU/ml（A1153,Sigma），置入-80℃冰箱冷冻储存待测。根据ELISA试剂盒的操作说明书进行。在每孔中加入50 μl的样本、标准品和阳性对照，随后每孔中加入25 μl的结合蛋白、生物素，在室温下孵育2 h，后加入辣根过氧化物酶溶液100 μl/孔，室温下孵育1 h。最后加入底物溶液100 μl/孔，1 h后终止反应，在450 nm读取光密度（OD）值。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用配对t检验或重复测量设计的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠体重、血压、心率及Catestatin浓度的变化情况

两组大鼠体重比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同周龄大鼠的体重有差异（F=528.100，P=0.000）；②两组大鼠体重有差异（F=85.813，P=0.000），SHR组的体重小于WKY组；③两组大鼠体重随周龄的变化趋势有差异（F=15.635，P=0.000），WKY组体重随周龄增加的更快。见表1和图1。

两组大鼠血压比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同周龄大鼠的血压有差异（收缩压：F=70.913，P=0.000，舒张压 ：F=37.938，P=0.000）；②两组间血压有差异（收缩压：F=429.93，P=0.000，舒 张 压：F=211.850，P=0.000），SHR组血压高于WKY组；③两组血压变化的趋势有差异（收缩压：F=61.622，P=0.000，舒张压 ：F=32.914，P=0.000），SHR组血压随周龄增长呈增加趋势，WKY组保持不变。见表2和图2。

两组大鼠心率比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同周龄大鼠的心率有差异（F=6.618，P=0.005）；②两组间心率有差异（F=51.021，P=0.005），SHR组心率高于WKY组；③两组心率随周龄增加的变化趋势有差异（F=0.395，P=0.678）。见表3和图3。

两组大鼠血浆Catestatin浓度比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同周龄大鼠的血浆Catestatin浓度有差异（F=15.101，P=0.000）；②两组间血浆 Catestatin浓度有差异（F=129.198，P=0.000），SHR组Catestatin浓度高于WKY组，SHR组的Catestatin浓度随周龄的增加逐渐升高，而WKY组则保持不变；③两组血浆Catestatin浓度变化趋势有差异（F=11.697，P=0.000）。见表4和图4。

表1 两组大鼠体重的比较（n=7，g，±s）

表1 两组大鼠体重的比较（n=7，g，±s）

组别 6周 12周 16周WKY 组 157.0±13.6 302.9±12.6 330.3±15.1 SHR 组 141.9±12.2 238.9±14.8 268.9±16.4

图1 两组大鼠体重变化趋势

表2 两组大鼠血压的比较 （n=7，mmHg，±s）

表2 两组大鼠血压的比较 （n=7，mmHg，±s）

注：1 mmHg=0.133 kPa

收缩压组别舒张压6周 12周 16周 6周 12周 16周WKY 组 118.9±7.9 123.0±5.7 119.7±4.4 85.7±7.2 91.1±8.1 80.6±8.9 SHR 组 146.6±7.5 193.3±11.7 205.4±8.9 107.7±4.7 153.1±9.7 145.6±13.3

图2 两组大鼠收缩压、舒张压变化趋势

表3 两组大鼠心率的比较（n=7，次 /min，±s）

表3 两组大鼠心率的比较（n=7，次 /min，±s）

组别心率6周 12周 16周WKY 组 363±18 346±18 344±15 SHR组 415±21 398±22 404±11

图3 两组大鼠心率变化趋势

2.2 Catestatin对SHR心率和血压的影响

与给药前比较，给药后30min心率有下降（P＜0.05），但血压无变化。见表5。

表4 两组大鼠血浆Catestatin浓度比较（n=7，ng/ml，±s）

表4 两组大鼠血浆Catestatin浓度比较（n=7，ng/ml，±s）

组别血浆Catestatin浓度6周 12周 16周WKY 组 1.10±0.28 1.05±0.21 1.17±0.12 SHR 组 1.60±0.54 1.76±0.26 3.03±0.57

图4 两组大鼠血浆Catestatin浓度变化趋势

表5 Catestatin 对心率和血压的影响 （n=7，±s）

表5 Catestatin 对心率和血压的影响 （n=7，±s）

心率 /（次/min）给药前 196.3±4.3 150.0±8.7 417.6±20.9给药后 30 min 197.0±6.4 144.4±8.8 378.1±15.6 t值 -0.306 2.032 6.604 P值 0.770 0.088 0.001组别 收缩压/mmHg舒张压/mmHg

3 讨论

本研究发现，SHR组不仅血压高于WKY组，心率也高于WKY组，说明交感神经激活是高血压的重要发病机制。目前已有一些学者对Catestatin与高血压的关系进行初步的研究。O'CONNOR等[7]研究表明，不仅高血压患者血浆Catestatin水平是降低的，而且在有高血压家族史但尚未出现高血压的人群中Catestatin也是降低的。但后续的研究结果并不一致，MENG等[8]研究显示，高血压患者血浆Catestatin水平升高，Catestatin/去甲肾上腺素的比值降低。而且在另外一些伴有交感神经激活的心血管疾病，比如心力衰竭、急性心肌梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病中，血浆Catestatin也升高[9-11]。从该既往的研究结果可以看出，Catestatin和交感神经激活有密切的关系。但上述研究均为横断面的调查，本研究在SHR组的发育过程中的不同阶段进行检测，发现血浆Catestatin的水平是逐渐升高的，与此同时，WKY组大鼠则无这种趋势，进一步提示Catestatin可能参与高血压的发病过程，也弥补了既往研究的缺陷。

KENNEDY等[6]研究表明，Catestatin能够抑制电刺激大鼠引起的血压及心率的升高。MAHAPATRA等[12]研究则表明，小鼠基因敲除嗜铬粒蛋白A可引起高血压，外源性补充Catestatin能够降低血压血压正常。FUNG等[13]发现，应用苯肾上腺素可诱导血管收缩，随后予以Catestatin可使收缩的血管舒张。本研究均提示，Catestatin可抑制与交感神经活化相关的血压升高。

在本研究中，尽管SHR组血浆中Catestatin升高，本室仍然尾静脉注射给予Catestatin治疗，发现可下降SHR组的心率。这说明Catestatin具有在实际高血压个体中具有抑制交感神经活性的作用，也说明SHR组血浆中Catestatin的升高是交感神经活性增高的一种代偿反应。Catestatin未能降低血压，笔者认为可能是单一的Catestatin治疗不足以使血压下降。也可能是给药途径的问题，比如近期发表的另外一项研究表明，从中枢神经系统泵入Catestatin可下降血压[14]。

就目前的研究结果而言，Catestatin能够抑制交感神经活化的指标均为心率、血压以及血浆中的去甲肾上腺素水平，该指标都是血流动力学方面的间接反映交感神经的方法，而未直接记录交感神经活化程度的指标，比如，微神经图技术记录传出神经节肌肉交感神经放电率，放射性标记的去甲肾上腺素溢出率的测定[15]，以及交感神经纤维的直接标记[16]，未来的研究需要应用该指标进一步验证Catestatin的抗交感激活作用。