刘文彬，吴立蓉，汪洁，李小波，植奇升

(1.广东药科大学生命科学与生物制药学院/广东省生物活性药物研究重点实验室，广东 广州 510006； 2.广州新海医院检验科，广东 广州 510300)

人β防卫素-2(human β defensin-2,hBD-2)是一种来源于皮肤、呼吸道等上皮组织的阳离子抗菌肽[1]。hBD-2在皮肤天然免疫中发挥了重要的作用，当皮肤发生细菌感染或者炎症时，可通过NF-κb通路和丝裂原活化蛋白激酶途径活化，使hBD-2的表达水平显著升高，hBD-2可通过直接杀灭病原菌和参与获得性免疫应答发挥抗菌功能[2]。酸性成纤维细胞生长因子(human acidic fibroblast growth factors,haFGF)是成纤维细胞生长因子家族成员之一。haFGF具有广泛的生物学作用，能诱导多种细胞分化、增殖、营养和保护神经元，促进伤口修复，诱导缺血区血管形成[3]。研究发现haFGF-1对创伤、糖尿病溃疡等多种皮肤损伤都有良好的促愈合作用[4]。hBD-2和haFGF-1可在痤疮的治疗中发挥协同作用，同时发挥抑菌、调节免疫和促进伤口愈合的作用。融合技术可有效构建双功能蛋白，通过构建hBD-2和haFGF融合蛋白，有助于为痤疮的治疗开发新型治疗药物。因此，本研究拟通过构建hBD2-haFGF1融合基因，原核表达获得hBD2-haFGF1蛋白，通过生物信息学分析获得融合蛋白的理化性质，为进一步的分离纯化和药理活性研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Prime STAR HS 高保真酶(日本Takara公司)；T4连接酶(美国NEB公司)；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)；快速质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)；EcoRⅠ 限制性内切酶(美国NEB公司)；XhoⅠ 限制性内切酶(美国NEB公司)；胰蛋白胨(广东环凯微生物科技有限公司)；逆转录试剂盒(日本Takara公司)；总RNA提取试剂盒(碧云天生物技术公司)；酵母粉(广东环凯微生物科技有限公司)。大肠埃希菌E.coliDH-5α、大肠埃希菌E.coliBL(21)和pET21b载体均为本室保存。

1.2 方法 1.2.1 引物的设计与合成

依据hBD-2基因序列(GenBank: AF071216.1)和haFGF-1基因序列(GenBank: 15055546)分别设计2对PCR引物。见表1。采用碧云天mRNA提取试剂盒采集人肝癌细胞HepG2 mRNA，检测RNA纯度和质量合格后，反转录成cDNA。以cDNA为模板分别扩增hBD-2基因和haFGF-1基因。RT-PCR体系：Primer STAR HS 10 μL，dNTP 4 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，模板1 μL，加入ddH20至50 μL。反应程序：98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，程序运行30个循环。1.5%琼脂糖凝胶电泳，天根琼脂糖回收试剂盒回收目标条带，送上海英潍捷基测序。

表1 hBD-2和haFGF-1 RT-PCR引物Table 1 RT-PCR primers for hBD-2 and haFGF-1

1.2.2 SOE-PCR构建hBD2-haFGF1融合基因

另设计2对引物，见表2。分别扩增hBD-2-linker基因和linker-haFGF-1基因，琼脂糖凝胶电泳分别回收基因条带。同时以hBD-2-linker基因和linker-haFGF-1基因为模板扩增hBD2-haFGF1融合基因，反应体系：Primer STAR HS 10 μL，dNTP 4 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，hBD-2-linker0.5 μL，linker-haFGF-1 0.5 μL，加入ddH20至50 μL。反应程序：98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，程序运行30个循环。1.5%琼脂糖凝胶电泳回收目标条带，送上海英潍捷基测序。

表2 hBD-2-linker和linker- haFGF-1 PCR引物Table 2 PCR primers for hBD-2-linker and linker-haFGF-1

1.2.3hBD2-haFGF1/pET21b表达载体的构建

融合基因分别在F端引入了EcoRⅠ 酶切位点，在R端引入了XhoⅠ 酶切位点，并且均设计了保护碱基，因此分别对hBD2-haFGF1融合基因和pET21b质粒进行双酶切，反应体系：质粒/基因1 μg、EcoRⅠ 1 μL，XhoⅠ 1 μL，buffer 5 μL，加入ddH20至50 μL，37 ℃反应2 h。琼脂糖凝胶电泳，分别回收588 bp和5 400 bp左右条带。

构建hBD2-haFGF1基因和pET21b T4连接体系，反应体系：hBD2-haFGF1∶pET21b=3∶1(摩尔比)，T4连接酶1 μL，buffer 1 μL，加入ddH20至10 μL，16 ℃反应4 h。连接产物转化E.coliDH-5α，Amp+LB板筛选阳性转化子。对阳性转化子分别进行PCR和酶切鉴定，另提取hBD2-haFGF1/pET21b质粒送公司测序，随后将鉴定正确的hBD2-haFGF1/pET21b表达载体转化入大肠埃希菌E.coliBL(21)构建hBD2-haFGF1/pET21b/BL(21)工程菌。

1.2.4 hBD2-haFGF1重组蛋白的诱导表达和SDS-PAGE检测

从LB培养板中随机挑取hBD2-haFGF1/pET21b/BL(21)单菌落培养过夜活化，以1∶100(V∶V)接种于新的LB液体培养基中，培养3.5 h后，加入终浓度为0.75 mmol/L的IPTG，诱导继续培养4 h，收取菌液，离心去除培养基，超声破碎，12 000 r/min离心，分别取诱导前全菌和诱导后全菌、诱导后上清、诱导后沉淀进行SDS-PAGE，碧云天超快速染色试剂盒染色。

诱导后的蛋白经过SDS-PAGE后，转膜，封闭1 h，TBST洗涤3次，小鼠抗人6×His抗体4 ℃孵育过夜(1∶2 000)，TBST洗涤3次，室温孵育二抗1 h，TBST洗涤3次，化学发光，成像系统扫描。

1.2.5 hBD2-haFGF1重组蛋白的生物信息学分析[5]

hBD2-haFGF1物理化学性质采用ProtParam tool工具进行分析。二级结构预测采用SOPMA Secondary Structure Prediction Method，预测蛋白的二级结构和折叠类型。氨基酸保守区域分析采用CDD工具。采用ProtScale工具分析各氨基酸的疏水性。三级结构预测采用CBS预测分析生成，采用SPDBV_4.10软件导出三维构象图片。

2 结果

2.1 hBD-2基因和haFGF-1基因的克隆

以人肝癌细胞HepG2 cDNA为模板，使用特异引物进行RT-PCR扩增，分别扩增获得123 bp的hBD-2基因和420 bp的haFGF-1基因，同预期相符。见图1。

1234567420bp123bp

1、2、3.hBD-2基因； 4. DL10000 marker； 5、6、7.haFGF-1基因。

图1RT-PCR扩增hBD-2基因和haFGF-1基因

Figure1RT-PCR amplification ofhBD-2 andhaFGF-1 gens

2.2 hBD2-haFGF1融合基因的构建

通过新设计的引物扩增获得了168 bp的hBD-2-linker基因和465 bp的linker-haFGF-1基因，随后通过SOE-PCR，获得588 bp左右hBD2-haFGF1融合基因条带，hBD-2和haFGF-1基因之间采用45 bp的linker基因连接。见图2。

2.3 hBD2-haFGF1/pET21b原核表达载体的构建和鉴定

构建好的hBD2-haFGF1/pET21b分别通过PCR和双酶切进行鉴定，PCR结果显示阳性转化子在588 bp左右有阳性条带。通过EcoRⅠ 和XhoⅠ 双酶切，可见588 bp和5 300 bp左右的条带，符合预期片段大小，见图3。进一步的测序结构显示基因序列比对符合率100%，无基因突变(结果未展示)。

1234200500100020004000700010000bp

1. DL10000 marker； 2.hBD-2-linker基因； 3.linker-haFGF-1基因； 4.hBD2-haFGF1融合基因。

图2SOE-PCR构建hBD2-haFGF1融合基因

Figure2Construction ofhBD2-haFGF1 fusion gene by SOE-PCR

200500100020004000700010000bp200500100020004000700010000bp12345612345

A.hBD2-haFGF1/pET21b PCR鉴定：1. DL10000； 2.空白对照组； 3、4、5. 阳性转化子； 6.阳性对照。B.hBD2-haFGF1/pET21b 双酶切鉴定：1. DL10000； 2.hBD2-haFGF1/pET21b； 3和4分别为EcoRⅠ 和XhoⅠ 单酶切； 5.EcoRⅠ 和XhoⅠ 双酶切。

图3hBD2-haFGF1/pET21b原核表达载体的构建和鉴定

Figure3Construction and identification of prokaryotic expression vector ofhBD2-haFGF1/pET21b

2.4 hBD2-haFGF1蛋白的诱导表达和鉴定

比较诱导前后的菌体，诱导后的全菌在23 800左右有明显蛋白条带(图4A)，Western blot结果同样显示在23 800左右有特异条带，表明hBD2-haFGF1蛋白得到正确表达。比较超声破碎离心后的上清和沉淀，可发现表达主要存在于沉淀中(图4A)，hBD2-haFGF1蛋白主要以包涵体形式存在。见图4。

2.5 hBD2-haFGF1蛋白的生物信息学分析2.5.1 一般性质

融合蛋白的氨基酸数目为220个，理论分子量为23 800，理论pI为8.81，分子式为C1040H1619N305O313S13，预测半衰期在哺乳动物中>30 h，在酵母中>20 h，在大肠埃希菌中>10 h。不稳定指数(instability index)为41.82，为不稳定蛋白。脂溶性指数(aliphatic index)61.59。两亲性指数(grand average of hydropathicity)为-0.609。氨基酸序列： MASMTGGQQMGRGSEFGIGDPVTCLKSGAICHPVFC PRRYKQIGTCGLPGTKCCKKPGGGGSGGGGSGGGGS FNLPPGNYKKPKLLYCSNGGHFLRILPDGTVDGTRD RSDQHIQLQLSAESVGEVYIKSTETGQYLAMDTDGLLY GSQTPNEECLFLERLEENHYNTYISKKHAEKNWFVGL KKNGSCKRGPRTHYGQKAILFLPLPVSSDLEHHHHHH。

AB1234512?103705540352515?103705540352515100

A. hBD2-haFGF1蛋白的SDS-PAGE分析：1. protein marker； 2.诱导前全菌； 3.诱导后全菌； 4.诱导后超声破碎后上清； 5.诱导后超声破碎后沉淀。B. hBD2-haFGF1蛋白的Western blot鉴定：1. protein marker； 2.诱导后全菌。

图4hBD2-haFGF1蛋白的诱导表达和鉴定

Figure4Inducible expression and identification of hBD2-haFGF1 protein

2.5.2 hBD2-haFGF1蛋白的二级结构分析

hBD2-haFGF1融合蛋白主要由延伸链(extended strand)(27.27%)、β转角(Beta turn)(13.18%)和随机卷曲(random coil)(53.64%)组成。见表3、图5。

2.5.3 hBD2-haFGF1蛋白保守结构域分析

经过NCBI CDD程序分析显示，融合蛋白N端有β防御素保守结构域，C端具有FGF超家族保守结构域，E-value值显示均两者具有高度同源性。见图6。

表3 hBD2-haFGF1蛋白的二级结构分布Table 3 Secondary structure distribution of hBD2-haFGF1 protein

1001505010015050

注:蓝线：helix； 红线：bridge； 绿线：turn； 紫线：coil。

图5hBD2-haFGF1蛋白的α螺旋、β转角和无规则卷曲的分布

Figure5Distribution of alpha helix,beta turn and random coil of hBD2-haFGF1 protein

2550751001251501752002201

图6hBD2-haFGF1蛋白的保守结构

Figure6Conservative domain of hBD2-haFGF1 protein

2.5.4 hBD2-haFGF1蛋白的疏水性分析

疏水性分析结果显示hBD2-haFGF1蛋白为亲水性蛋白。第108位天冬氨酸具有最高的亲水性(-2.767)，205位亮氨酸具有最高的疏水性(-2.389)。见图7。

2.5.5 hBD2-haFGF1蛋白的三级结构预测

利用CBS结果预测hBD2-haFGF1蛋白的三级结构，SPDBV_4.10可视化后显示hBD2-haFGF1蛋白的三级结构如图8所示。

3210-1-2-3SCOreRrotScaleoutputforuser_sequenceHphob./Kyte&DoolittlePosition10015020050

图7hBD2-haFGF1蛋白的疏水性分析

Figure7Hydrophobicity analysis of hBD2-haFGF1 protein

图8hBD2-haFGF1蛋白的三级结构构

Figure8Tertiary structure of hBD2-haFGF1 protein

3 讨论

痤疮是一种常见的毛囊、皮脂腺慢性炎症疾病，其发病主要与痤疮丙酸杆菌(P.acnes)、皮脂腺导管的角化、皮脂大量分泌、炎症因子产生有关[6]。痤疮的治疗以抗菌、抗角化、抗雄性激素和抑制瘢痕形成为主[7]。痤疮是一种自限性疾病，临床治疗过程中应避免使用副作用大的药物，同时严重痤疮如果得不到妥善治疗，痤疮导致的色素沉着和较大的瘢痕往往难以修复，极大地影响患者的美观和心理健康，为此开发新型抗痤疮药物有其现实意义。

hBD-2具有抗菌活性和免疫调节功能，可通过直接与细菌细胞膜结合，破坏细胞膜完整性，从而导致菌体死亡，还可趋化树突状细胞和记忆T细胞，提高机体获得性免疫水平[8]。在痤疮病损部位，P.acnes为hBD-2的主要诱导源，P.acnes可刺激皮脂腺细胞产生抗菌肽和hBD-2[9]。haFGF和碱性成纤维因子(bFGF)均可用于痤疮的治疗，如与点阵铒激光、微晶磨面等技术相结合，促进痤疮患者瘢痕创面的愈合，下调Ⅰ型前胶原基因的表达，减少I型胶原、Ⅲ型胶原、TGF-β1、VEGF的含量[10]。相对于hbFGF，haFGF结合能力更强，更适合创面酸性环境，更为温和持久的生物学活性，在痤疮中可取得更佳的治疗效果[11]。

基因融合技术可将不同的基因连接从而表达出具有多重功能的融合蛋白[12]。本研究中首先采用RT-PCR技术获得hBD-2基因和haFGF-1基因，随后采用SOE-PCR技术构建了hBD2-haFGF1融合基因，融合蛋白之间过近的连接可影响蛋白质的空间结构，从而影响蛋白质的功能活性，一般以5～25个氨基酸为宜[13]。本研究中采用了15个氨基酸的(Gly4Ser)3柔性连接，Gly有助于增强linker的柔性，而Ser有助于增强linker的亲水性。经过IPTG的诱导，hBD2-haFGF1融合蛋白得到有效表达。hBD2-haFGF1融合蛋白以包涵体表达的形式存在，hBD-2作为抗菌肽，可对工程菌产生毒性，而包涵体表达则可避免对工程菌的杀伤作用，有助于蛋白的大量表达。

hBD2-haFGF1蛋白作为自然界不正常存在的蛋白，缺少对其相关信息的认知，这也阻碍了对其进一步的研究。生物信息学是20世纪80年代兴起的一门交叉学科，是以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学[14]。本研究分别采用ProtParam tool、SOPMA Secondary Structure Prediction Method、CDD、ProtScale和CBS等生物信息学工具对hBD2-haFGF1的相关理化性质进行了预测。hBD2-haFGF1的理论分子量为23 800，理论pI为8.81。在E.coli中半衰期>10 h，表明hBD2-haFGF1适合在原核系统中表达。不稳定指数(instability index)为41.82，为一个不稳定的蛋白，提示在后续的分离纯化中应注意避免蛋白的降解。脂溶性指数61.59表明蛋白具有较好的热稳定性。hBD2-haFGF1蛋白保留了β防御素保守结构域和FGF超家族保守结构域。疏水性分析结果显示hBD2-haFGF1蛋白为亲水性蛋白，便于进一步的分离纯化。

综上所述，本研究构建了hBD2-haFGF1融合基因的原核表达载体，并成功在体外诱导表达了hBD2-haFGF1蛋白，并对融合蛋白的理化性质进行了生物信息学分析。本研究为进一步的蛋白分离纯化和药理活性研究提供了基础。