冯莉芳，涂毅，张玲莉

(1.武汉大学人民医院感染管理办公室； 2.武汉大学人民医院药学部,湖北 武汉 430060)

临床调查发现人们经常吃蔬菜和水果患消化道癌症的几率较低，其原因可能是由于蔬菜和水果中存在一种或多种抑制肿瘤发展的植物活性物质。萝卜硫素(sulforaphane，SFN)是一种具较强抗癌作用的植物活性成分，主要在西兰花、花椰菜及甘蓝菜等蔬菜中含量较高[1]。研究发现萝卜硫素是一种多功能酶诱导物，能够诱导Ⅱ型解毒酶的产生，从而发挥抗癌的效果[2-4]。胃癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，在肿瘤发病率中稳居第4位，而在我国每年新增患者占全球的40%。由于对胃癌的早期诊断率较低，而且胃癌是一种多因素、发病机制复杂的肿瘤，目前对其发病机制的研究还不能解释很多问题，所以在胃癌诊断和治疗的研究中还存在较大空间[5-7]。目前，较多的研究报道萝卜硫素可以预防、延缓或逆转肿瘤出现前的病变，能够对多种肿瘤具有较好的预防作用，是一种颇有价值的抗肿瘤活性成分[8]。前期也研究证实了萝卜硫素对氧化应激引起的胃黏膜损伤具有保护和修复作用，并且还能对胃黏膜的炎性反应起到抑制效果[9]。本文研究萝卜硫素对人胃癌细胞HGC27的抑制作用及其可能的作用机制，以期为萝卜硫素的临床应用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

HGC27人胃癌细胞株(武汉巴菲尔生物有限公司)；萝卜硫素(上海原叶生物科技有限公司，HPLC检测质量分数≥99%，批号：CAS:142825-10-3)，采用二甲基亚砜(DMSO)溶解制备成储存液，使用前稀释成相应浓度便可；ATP标准品(Sigma公司，批号：CFAD-A3377-1G)；DCFH-DA(Sigma公司，批号：2044-85-1)；CCK8试剂盒(Sigma公司)；DMEM培养基(上海吉诺公司)；胎牛血清(FBS，四季青公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、SDS-PAGE凝胶试剂盒均购自碧云天生物科技有限公司；抗体Bax、Bcl-2、p53、及β-actin均购自美国Abcam公司。

高效液相色谱仪LC-20AD型(日本岛津公司)；Victor3 1420 Multilable Counter酶标仪(DX540，美国)；F2500荧光分光光度计(日本日立公司)；单人超净台(苏州华新空调净化有限公司)；细胞培养箱(上海医用分析仪器厂)；SDS-PAGE凝胶电泳(型号DYCZ-24DN，北京六一仪器厂)；成像系统(BIO-RAD，美国)。

1.2 HGC27细胞培养

将HGC27细胞常规接种于含10%FBS、1%双抗(100 U/mL青霉素-100 μg/mL链霉素)的DMEM培养基中，置于37 ℃、5%CO2浓度的培养箱中培养。待细胞生长至90%左右时进行传代培养。

1.3 CCK8法检测细胞存活率

将对数生长期的HGC27细胞消化、重悬、计数后以1×104/孔细胞数接种于96孔板中，每孔终体积为200 μL，每组设置6个平行孔。培养过夜待细胞贴壁后，弃去原培养基，加入200 μL不同浓度的萝卜硫素培养液(20、40、80 μg/mL)，培养24、48、72 h后，吸去旧培养基，向各孔加入10 μL CCK8试剂，37 ℃、5%CO2浓度的培养箱中继续孵育1 h，酶标仪450 nm波长处测定各孔吸光度值(A值)，计算细胞存活率SR。SR=实验组A值/对照组A值×100%。

1.4 DCFH-DA法检测细胞内ROS活性

HGC27细胞经不同浓度萝卜硫素干预处理24 h后，将细胞消化并收集于1.5 mL Ep管中，1 500 r/min离心5 min，倒掉上清，向细胞沉淀中加入1 mL DCFH-DA溶液，吹打混匀后37 ℃孵育30 min，再加入PBS终止反应。接着1 500 r/min离心5 min，倒掉上清，收集细胞沉淀，并加入PBS重悬细胞，用F2500荧光分光光度计测定荧光值。其中激发波长设置为488 nm，发射波长设置为525 nm。

1.5 HPLC测定细胞内ATP水平

HGC27细胞经不同浓度萝卜硫素干预处理24 h后，消化、离心，收集细胞，向细胞中加入0.4 mol/L的高氯酸0.5 mL，吹打混匀后置于-80 ℃冰箱中储存。待检测前取出细胞置于冰上解冻，4 ℃、13 000 r/min离心10 min，取20 μL上清进样分析。色谱条件为：日本岛津公司ODS-SP C18(4.6 mm×250 mm，粒径5 μm)色谱柱，流动相为50 mmol/L磷酸盐缓冲液-甲醇(95∶5)，柱温30 ℃，流速0.5 ml/min，检测波长为254 nm。

1.6 蛋白浓度测定

ROS活性及ATP含量检测中所设计的蛋白浓度检测均用BCA试剂盒，其操作步骤严格按照说明书进行。

1.7 Western blot检测Bax、Bcl-2及p53蛋白的表达水平

HGC27细胞经不同浓度萝卜硫素干预处理24 h后，消化、离心，收集细胞，加入RIPA裂解液在冰上充分裂解细胞，4 ℃、12 000 r/min离心12 min，提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。每孔上样量为30 μg，采用15%的SDS-PAGE凝胶分离蛋白，70 V电泳；在冰水浴中275 mA恒流条件下转膜。5%脱脂奶粉常温下封闭1 h，4 ℃条件下孵育一抗过夜，TBST漂洗3次后室温下孵育二抗，再TBST清洗3次后，在ECL试剂中显色，Bio-Rad发光系统成像。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 萝卜硫素对HGC27细胞存活率的影响

HGC27细胞经不同浓度萝卜硫素干预处理24、48、72 h后，各剂量组细胞存活率显著低于溶剂对照组(P<0.05)，并且与萝卜硫素剂量间存在一定的浓度依赖性。在同一剂量的萝卜硫素干预下，随着药物干预处理的时间延长，细胞存活率也呈现出降低的趋势。见表1。

表1 萝卜硫素对HGC27细胞存活率的影响Table 1 Effect of sulforaphane on the survival rate of HGC27 cells

与溶剂对照组比较：aP<0.05； 与20 μg/mL萝卜硫素组比较：bP<0.05； 与40 μg/mL萝卜硫素组比较：cP<0.05。

2.2 萝卜硫素对HGC27细胞ROS活性及ATP含量的影响

HGC27细胞经不同浓度萝卜硫素干预处理24 h后，细胞内ROS水平显著降低(P<0.05)，ATP含量也显著降低(P<0.05)，并且均表现出浓度依赖性。见表2。

2.3 萝卜硫素对HGC27细胞中Bax、Bcl-2及p53蛋白表达的影响

HGC27细胞经不同浓度萝卜硫素干预处理后，促凋亡蛋白Bax和抑癌蛋白P53表达水平均显著升高(P<0.05)，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平则显著降低(P<0.05)，均表现出剂量依赖性。见图1。

表2 萝卜硫素对HGC27细胞ROS活性及ATP含量的影响

组别剂量/(μg·mL-1)ROS/(Fluo unit·mg-1)ATP/(μg·mg-1)溶剂对照组03 853±19713.98±1.52萝卜硫素 低剂量组203 250±164a10.22±1.13a 中剂量组402 658±133ab8.67±0.85ab 高剂量组801 845±115abc6.94±0.65abc

与溶剂对照组比较：aP<0.05； 与20 μg/mL萝卜硫素组比较：bP<0.05； 与40 μg/mL萝卜硫素组比较：cP<0.05。

1234abcabaabcabcababaaBax/β-actinBcl-2/β-actinp53/β-actinBaxp53Bcl-2β-actin0.80.60.40.20.00.60.40.20.00.80.60.40.20.01234

1.溶剂对照组； 2. 20 μg/mL萝卜硫素组； 3. 40 μg/mL萝卜硫素组； 4. 80 μg/mL萝卜硫素组。与溶剂对照组比较：aP<0.05； 与20 μg/mL萝卜硫素组比较：bP<0.05； 与40 μg/mL萝卜硫素组比较：cP<0.05。

图1萝卜硫素对HGC27细胞中Bax、Bcl-2及p53蛋白表达的影响

Figure1Effect of sulforaphane on the expression of Bax,Bcl-2 and p53 proteins in HGC27 cells

3 讨论

用不同浓度萝卜硫素对人胃癌细胞HGC27进行干预处理后，采用CCK8方法对细胞的相对存活率进行检测发现，萝卜硫素能够有效抑制HGC27细胞的生长增殖，并且表现出一定的时间-剂量依赖关系。肿瘤细胞表现出的一个重要特征是生长速度极快，使得恶变组织在短期内体积增长较快，而此时血管形成相对较慢，导致局部缺血缺氧微环境的形成。肿瘤细胞的缺血缺氧会导致线粒体产生较多的活性氧自由基(ROS)，会引发氧化应激损伤[10]。过量的ROS会导致核DNA的损伤、线粒体DNA的突变、蛋白质及脂质的过氧化[11]。除此之外，ROS还可以介导肿瘤细胞生长信号通路的传导，在肿瘤的发生与发展过程中起着重要的调控作用[12]。本文研究发现萝卜硫素可以有效抑制HGC27细胞内ROS的水平。另外，肿瘤细胞与正常细胞的主要区别在于前者代谢产生的ATP来自于糖酵解过程[13]。前期也有研究发现3-溴代丙酮酸(3-BrPA)能够通过抑制癌细胞中ATP的合成，进一步引发肿瘤细胞的死亡[14]。本研究也表明萝卜硫素可以显著抑制HGC27细胞内ATP的生成，可能是萝卜硫素抑制肿瘤细胞增殖的主要原因之一。

Bax是Bcl-2家族中重要的促凋亡蛋白，其作用机制主要是与Bcl-2形成异源二聚体达到抑制Bcl-2的抗凋亡作用，还可以自身形成同源二聚体促使癌细胞凋亡[15]。活化的Bax可以诱导线粒体释放细胞色素C，进一步引发细胞凋亡[16]。并且前期研究发现Bax的表达水平与人胃的病变严重程度呈负相关性，提示Bax表达的增加可以促使肿瘤细胞凋亡[15]。本研究也发现萝卜硫素能够明显诱导促凋亡蛋白Bax的表达，而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。p53是一种抑癌基因而分布在各种组织细胞中，在DNA损伤的应答反应中，损伤因子通过诱导p53来抑制细胞周期，已达到修复DNA损伤的作用[17]。一旦DNA遭受到无法恢复的损伤，细胞将会进入程序化死亡途径[18]。本研究亦发现萝卜硫素可以通过诱导p53的表达来促使HGC27细胞凋亡的发生。

综上，萝卜硫素可以有效抑制HGC27细胞增殖，其作用机制可能与调控氧化应激水平、抑制ATP生成、上调Bax、p53及下调Bcl-2蛋白表达水平有关。