高纳影，贾秀娟，孙华庚，赵艳敏，刘岱琳，高晓霞

(1.广东药科大学药学院，广东广州 510006； 2.山东东阿阿胶股份有限公司，山东聊城 252299； 3.天津市尖峰天然产物研究开发有限公司，天津 300309； 4.中国人民武装警察部队后勤学院生药学与药剂学教研室，天津 300162)

连翘为木犀科连翘属的落叶灌木植物，主产于我国河南、河北、陕西、山西等地，具有清热解毒、消肿散结等功效[1]。现代药理研究显示,连翘具有抗菌、抗病毒、防护肝损伤等多种作用[2]，化学成分研究发现其主要活性成分是木脂素、苯乙醇苷、黄酮、三萜等[3]。

近年来，连翘中的质量控制成分主要以连翘苷和连翘酯苷A为主，也有芦丁等黄酮类成分的含量测定研究报道[4]，其他成分的含量报道相对较少。罗彬等[5]首次从连翘中分离得到了罗汉松树脂酚及其苷类成分。据报道，罗汉松树脂酚具有较强的抗氧化[6]、抗病毒[7]等活性。李晋等[8]研究发现连翘中还含有牛蒡子苷及其苷元。牛蒡子苷及其苷元具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒、扩张血管等多种活性[9]。本文采用高效液相色谱法测定不同产地、不同部位的连翘中罗汉松树脂酚苷、罗汉松树脂酚、牛蒡子苷及其苷元等4种成分的质量分数，旨在为连翘活性成分的研究及连翘植物的综合开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

连翘药材及其植物的不同部位均由天津市尖峰天然产物研究开发有限公司提供。连翘枝条分别采自河北(批号：20170911-1，20170911-2，20170911-3)和河南(批号：20170918-1，20170918-2，20170918-3)。从河北省采摘的连翘的茎、叶和果实的批号分别为20170925-1，20170925-2，20170925-3。所有样本经由武警后勤学院军事药学教研室张静泽副教授鉴定为木犀科连翘属植物连翘Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl的干燥的茎、枝、叶和果实，样品标本保存在天津市尖峰天然产物研究开发有限公司留样室。

罗汉松树脂酚苷(Matairesinoside)、罗汉松树脂酚(Matairesinol)、牛蒡子苷(Arctiin)、牛蒡子苷元(arctigenin)：天津市科曼思特医药科技发展有限公司，质量分数均>98%；乙腈(色谱纯)、甲醇(分析纯)、95%乙醇(分析纯)、正丁醇(分析纯)、冰乙酸(分析纯)：天津市康科德科技有限公司；娃哈哈纯净水。

1.2 仪器与设备

DZKW电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂)；ZDHW调温电热套(北京中兴伟业仪器有限公司)；梅特勒XS3DU 超微量电子天平(梅特勒-托利多中国仪器公司)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；SB-2000旋转蒸发仪(日本东京理化公司)；高效液相色谱仪(LC-20AT泵，SPD-M20A检测器，CTO-20A柱温箱，CBM-20A控制器，SIL-20A进样器，日本岛津公司)；Cosmosil色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，Nacalai Tesque)。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备 分别精密称取罗汉松树脂酚苷、罗汉松树脂酚、牛蒡子苷和牛蒡子苷元对照品适量，置于5 mL量瓶中，用70%(体积分数，下同)乙醇充分溶解并定容至刻度，配成浓度为1.032、1.083、2.102、0.1056 mg/mL的对照品溶液，0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得对照品储备液。

分别精密量取上述4种对照品储备液各1 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得混合对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液的制备 分别精密称取连翘果实、茎、枝、叶各2 g，置于100 mL提取用棕色量瓶中，加入60 mL 70%乙醇回流提取2 h，放至室温，用70%乙醇溶液定容至100 mL，0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得。

1.3.3 色谱条件与系统适用性试验 流动相：水为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱(0～20 min，20%→100%B；70～70.01 min，100%→20%B；70.01～75 min，20%B)；进样量：10 μL；流速：1 mL/min；检测器：DAD检测器；检测波长：220 nm，柱温：30 ℃。取混合对照品溶液和供试品溶液，按上述液相方法进行测定，记录色谱图，结果见图1。理论塔板数按牛蒡子苷计算应不低于6 000。

1251007550250-255004003002001000mAUmAU罗汉松树脂酚罗汉松树脂酚苷牛蒡子苷牛蒡子苷元罗汉松树脂酚苷牛蒡子苷罗汉松树脂酚牛蒡子苷元10.015.020.025.030.035.00.05.0t/minBA

A.混合对照品溶液； B.连翘枝供试品(批号20170911-1)溶液。

图1连翘中4种木脂素的HPLC色谱图

Figure1HPLC chromatograms of four lignanoids in Forsythiae

1.3.4 方法学考察

1.3.4.1 标准曲线的制备 分别精密吸取“1.3.1”项下的1.032 mg/mL的罗汉松树脂酚苷对照品储备液各0.1、0.5、2、5、10 mL至25 mL量瓶中，配成质量浓度分别为0.004 128、0.020 64、0.082 56、0.206 4、0.412 8 mg/mL的罗汉松树脂酚苷对照品溶液；精密吸取“1.3.1”项下的1.083 mg/mL的罗汉松树脂酚对照品储备液各0.1、0.5、1、1.5、2 mL至10 mL量瓶中，配成质量浓度分别为0.010 83、0.054 15、0.108 3、0.162 4、0.216 6 mg/mL的罗汉松树脂酚对照品溶液；精密吸取“1.3.1”项下的2.102 mg/mL的牛蒡子苷对照品储备液各0.1、0.5、1、2、5 mL至10 mL量瓶中，配成质量浓度分别为0.021 02、0.105 1、0.210 2、0.420 4、1.051 mg/mL的牛蒡子苷对照品溶液；精密吸取“1.3.1”项下的1.032 mg/mL的牛蒡子苷元对照品储备液各0.1、1、3、6、10 mL至10 mL量瓶中，配成浓度分别为0.001 056、0.010 56、0.031 68、0.063 36、0.105 6 mg/mL的牛蒡子苷元对照品溶液。

取上述各对照品溶液，按“1.3.3”项下进行分析，以峰面积(Y)对4种对照品溶液的质量浓度(X，mg/mL)进行线性回归方程，结果4种成分的线性回归方程及线性范围分别为：罗汉松树脂酚苷，Y=16.94×106X-31 604，R2=0.999 1，线性范围0.004 128～0.412 8 mg/mL；罗汉松树脂酚，Y=32.09×106X-45 554，R2=0.999 9，线性范围0.010 83～0.216 6 mg/mL；牛蒡子苷，Y=5.26×106X-13 714，R2=0.999 8，线性范围0.021 02～1.051 mg/mL；牛蒡子苷元，Y=7.29×106X+110 138，R2=0.999 4，线性范围0.001 056～0.105 6 mg/mL。

1.3.4.2 精密度试验 分别量取“1.3.1”项下的混合对照品溶液进样分析，平行测定6次，计算4种成分的峰面积RSD值，结果显示罗汉松树脂酚苷、罗汉松树脂酚、牛蒡子苷和牛蒡子苷元峰面积的RSD值分别为0.47%、0.31%、0.49%和0.73%，表明在该条件下仪器精密度良好。

1.3.4.3 稳定性试验 取连翘枝(批号20170911-1)按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.3”项下方法分别于0、2、4、6、8、10、12 h测定，计算4种成分的峰面积RSD值，结果显示罗汉松树脂酚苷、罗汉松树脂酚、牛蒡子苷和牛蒡子苷元峰面积的RSD值分别为1.41%、1.72%、1.53%、0.97%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

1.3.4.4 重复性试验 取连翘枝(批号20170911-1)6份，分别按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.3”项下色谱条件进行测定，结果显示罗汉松树脂酚苷、罗汉松树脂酚、牛蒡子苷和牛蒡子苷元4种成分的质量分数平均值分别为1.83%、0.62%、0.31%、0.089%，其RSD值分别为1.96%、1.71%、2.07%、1.80%，表明方法重复性良好。

1.3.4.5 加样回收率试验 分别精密称取6份已知质量分数的连翘枝样品(批号20170911-1)约1.0 g，按照表1所示精密称定各对照品适量加入样品中，按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.3”项下方法进行测定，计算加样回收率，结果测得回收率为97.7～105.4%，RSD为1.77%～2.65%，表明方法准确度良好。

1.3.5 样品测定 分别取各个批次样品3份，按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.3”项下的色谱条件下进行测定，计算4种成分的质量分数。

2 结果

2.1 两个产地连翘枝条中4种成分质量分数的比较

按“1.3.5”和“1.3.2”项下方法，考察河北省和河南省所产连翘枝条中4种成分的质量分数，结果见表2。可见，河北省和河南省所产的连翘枝条中4种成分的质量分数存在一定差异；整体而言，河北省所产的连翘枝条中4种成分的质量分数略高于河南省所产的连翘枝条原料，其中罗汉松树脂酚苷和牛蒡子苷的差异较大，而罗汉松树脂酚和牛蒡子苷元的差异不大，河南省的只是略低于河北省所产的原料。因此，以河北省所产原料进行后续试验。

表1 4种木脂素的加样回收率试验Table 1 Results of recovery test of four lignanoids in Forsythiae

表2 不同产地连翘枝条中4种木脂素成分的质量分数

Table2The contents of four lignanoids in Forsythiae from producing areasw/%

2.2 河北产区的连翘不同部位中4种成分的质量分数的比较

按“1.3.1”和“1.3.2”项下方法，考察采自河北地区连翘的果实、茎、枝和叶的不同组织部位中4种成分的质量分数，结果见表3。可见，4种成分在连翘不同部位中的分布差异较大，枝条中罗汉松树脂酚苷、罗汉松树脂酚的质量分数最高，分别为1.85%、0.63%；叶中牛蒡子苷及其苷元的质量分数最高，分别为3.93%、0.22%；果实中4种木脂素类成分的质量分数都相对较低。因此，可以选择连翘的枝条和叶作为开发罗汉松树脂酚苷、罗汉松树脂酚、牛蒡子苷和牛蒡子苷元提取物的原料。

表3 连翘不同部位中4种木脂素成分的质量分数

Table3TThe contents of four lignanoids in different parts of Forsythiae (n=3)w/%

3 讨论

《中国药典》收载连翘为果实入药，味苦，性微寒，具有散结消肿、清热解毒的功效，每年9月份采收的青翘质量最佳。每年秋季采收青翘后，连翘的枝条和叶作为废弃物，研究报道相对较少。木脂素类成分连翘苷和连翘酯苷A是连翘主要的指标成分，陈瑾等[10]研究了不同产地连翘果实中连翘苷和连翘酯苷A的质量分数，平均质量分数均在1%和7%以上。王金等[11]探讨了不同产地连翘叶中连翘苷和连翘酯苷A的质量分数，表明湖南和陕西的连翘叶中连翘苷和连翘酯苷A的质量分数均在1%和4%以上。目前，对连翘中其他木脂素类成分的质量分数研究较少。

本文建立了同时测定连翘植物中4种木脂素罗汉松树脂酚苷、罗汉松树脂酚、牛蒡子苷和牛蒡子苷元的HPLC法，色谱条件摸索过程中曾分别考察了水和体积分数分别为30%、50%、70%、95%的乙醇作为提取溶剂对测定结果的影响，结果显示：以70%乙醇为提取溶剂时，罗汉松树脂酚苷的质量分数最高，达1.85%；以50%乙醇为提取溶剂时，罗汉松树脂酚和牛蒡子苷的质量分数最高，分别为0.71%和0.39%；以95%乙醇为提取溶剂时，牛蒡子苷元质量分数最高，达0.093%。综合考虑不同溶剂下4种成分的提取效果，选取70%乙醇作为提取溶剂，可以获得较好的提取效果，从而保证测试结果贴近药材中的真实含量。

本研究结果显示，河北省产区的连翘植物茎叶4种木脂素成分的质量分数都略高于河南省所产的连翘枝条原料，其中罗汉松树脂酚苷和牛蒡子苷的质量分数差异较大，而罗汉松树脂酚和牛蒡子苷元的差异不大，只是略低于河北省所产的原料。在此基础上，本文还比较了河北省产区连翘植物不同部位中4种成分的质量分数，结果显示成分分布差异很大：枝条中罗汉松树脂酚苷、罗汉松树脂酚的质量分数最高；而叶中牛蒡子苷及其苷元的最高，罗汉松树脂酚的含量极低，已经超出了本文测定的线性范围；果实中4种木脂素类成分的质量分数都相对较低。以上结果提示，连翘的枝条和叶是可以作为开发罗汉松树脂酚苷、罗汉松树脂酚、牛蒡子苷和牛蒡子苷元提取物的原料的，既可以提高植物废弃物的利用率，也可促进连翘的综合开发。