彭爱红，王茜雅，林郑忠，陈晓梅，黄志勇

(集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021)

0 引言

隐性孔雀石绿(leuco malachite green,LMG)，又称无色孔雀石绿、二(对二甲氨基苯基)苯基甲烷，系三苯甲烷类碱性工业染料孔雀石绿(malachite green,MG)的还原产物。由于MG具有抑制细菌和寄生虫的作用，能够抗感染、延长水产品存活时间[1]，因而常被作为杀菌剂和防腐剂非法用于水产养殖中[2-3]。但是，由于MG具有潜在的致癌、致畸和致突变作用[2，4]，而且MG进入动物机体后，通过生物转化会快速代谢生成性质更稳定、毒性更强的脂溶性的LMG[5-6]，对人体生殖系统和免疫系统危害极大[7-8]。鉴于MG和LMG的危害，美国、加拿大、日本和欧盟等都禁止在水产养殖中使用MG，我国政府也于2002年将MG列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，禁止将MG用于所有食品动物的养殖及运输过程[9]。由于LMG比MG在水产品中的残留时间更长，因而其危害更大。为了更准确地对水产品中的MG残留进行监控，研究LMG残留的快速检测方法很有必要。

目前，MG残留的快速检测方法主要是酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)[10-12]，但现有的商品化的ELISA检测试剂盒主要是以MG为靶标，不能直接检测LMG，因而需将LMG转变成MG，使样品前处理变得复杂，且转化率难以控制[13]。分子印迹聚合物(molecular imprinted polymers,MIPs)具有类似生物抗体的高特异性结合反应，能够人工设计合成[14]。利用MIPs作为仿生抗体，可以使得ELISA检测更加简便、易于推广[15]。但由于常用的聚苯乙烯微孔板难以耐受乙腈、丙酮等有机溶剂，用传统的MIPs制备方法会不同程度地损坏微孔板而影响测定。因此，本文利用多巴胺(dopamine,DA)氧化-自聚合的原理，以pH=8.5的Tris-HCl溶液为介质，DA在溶解氧的作用下发生自聚合，在微孔板表层形成富含邻苯二酚基团，能强力附着于固体材料的聚多巴胺层[16]。以LMG为模板分子，在96孔板表层制备了LMG-MIP膜，以此膜为仿生抗体，建立了用于水产品中LMG快速检测的仿生ELISA法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

MB-100-4A微孔板振荡器(杭州奥盛仪器有限公司)；Spectra Max plus 384酶标仪(美谷分子仪器有限公司)；FD-1D-50真空冷冻干燥箱(北京博医康实验仪器有限公司)；HH-1数显恒温水浴锅(江苏省金坛市环宇科学仪器厂)；pH 211C pH计(意大利哈纳有限公司)；96孔酶标板(厦门市绿茵试剂玻仪有限公司)。

MG，AR，西陇化工股份有限公司；LMG，AR，Aladdin；过硫酸铵，AR，广东光华科技股份有限公司；盐酸多巴胺，AR，Macklin；辣根过氧化物酶(HRP)，AR，Aladdin；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，AR，西陇化工股份有限公司；三羟甲基氨基甲烷，BR，Aladdin；其他试剂均为国产分析纯，实验用水均为18.2 MΩ·cm超纯水，鲈鱼样品购买于集美新华都超市。

1.2 LMG仿生抗体分子印迹膜的制备

在96孔板内，每孔加入200 μL 1 mol/L过硫酸铵溶液，40 ℃水浴加热1 h，用超纯水超声清洗微孔板10 min，烘箱干燥后得到羟基化的微孔板。取一定量的LMG(200 mg/L)无水乙醇溶液于烧杯中，按体积比1∶1加入2 g/L多巴胺溶液(Tris-HCl配制，pH= 8.5)，混匀后加入羟基化的微孔板中，每孔300 μL，将微孔板置于微孔板振荡仪上室温振荡4 h。弃微孔板溶液，将微孔板置于V(甲醇)∶V(乙酸)=9∶1混合溶液中，超声波振荡清洗模板分子至少3次，每次15 min，最后用超纯水清洗至中性，于60 ℃烘箱干燥，即得到LMG-MIP膜微孔板。非印迹膜(NIPs)微孔板的制备除不加入模板分子LMG外，其余步骤同MIPs的制备方法。

1.3 LMG酶标抗原的合成

因LMG分子不含有羧基和氨基等活性基团与蛋白质偶联，因此必须对LMG半抗原进行结构改造引入羧基或氨基。参考Yang等[17]的方法制备羧基化隐性孔雀石绿。于圆底烧瓶中加入2.4 mL DMF(19 mmol/L)、900 mg对甲酰基苯甲酸(6 mmol/L)、2.4 g无水ZnCl2(18 mmol/L)和60 mL无水乙醇，超声振荡混合后，氮气下加热回流。反应结束后，加入30 mL甲醇，超声混匀，再加入少量氨水产生浅绿色沉淀，沉淀用超纯水清洗，真空干燥后即得到浅绿色粉末状的羧基化隐性孔雀石绿。

称取2 mg 羧基化LMG粉末，加入1 mL质量分数20% DMF，磁力搅拌下加入33 μL 碳二亚胺(EDC，2 g/L)DMF溶液，待溶解并混匀后，用稀醋酸调pH值至5.0，加入7.5 mg HRP，混匀后，用氨水调pH值至中性，室温下反应3 h，即得到LMG-HRP酶标抗原，于-20 ℃保存。

为了检测酶标抗原是否偶联成功，分别将HPR、半抗原羧基化孔雀石绿、酶标抗原LMG-HPR的偶联物等溶液进行紫外-可见光谱扫描，比较三者的特征峰值，以验证偶联反应的发生。

1.4 LMG仿生ELISA方法的建立

用V(无水乙醇)∶V(水)=3∶1混合溶液配制质量浓度为0.1，1，10，100，1000 μg/L LMG标准溶液，在LMG-MIPs孔板中每孔加入200 μL标准溶液，室温振荡1 h后，弃去溶液。迅速在每孔加入200 μL用磷酸缓冲溶液稀释800倍的LMG酶标抗原溶液(2 g/L)，室温继续振荡1 h，待反应结束后洗净孔板。加入150 μL 20 mmol/L邻苯二胺(OPD)显色液于每孔中并振荡30 min，再加入50 μL硫酸(2 mol/L)作为终止液，振荡1 min后，于酶标仪中测定微孔板中溶液在492 nm处的吸光度值。以不加LMG的孔板为对照组。

以LMG浓度的对数值为横坐标，以抗原抗体分子间结合反应的抑制率(即样品组的平均吸光度值与对照组的平均吸光度值之比)为纵坐标，绘制仿生ELISA标准曲线。

1.5 选择性试验

选择隐性结晶紫(leuco crystal violet,LCV)和MG作为LMG结构相似物进行方法的特异性试验。交叉反应率(cross-reactivity，CR)的计算公式如下：CR/%=IC50(LMG)/IC50(类似物)×100。

1.6 样品的加标回收实验

称取5.0 g新鲜鱼肉(去皮剔骨)，捣碎后加入体积分数20%盐酸羟胺1.5 mL和0.05 mol/L乙酸铵(pH=4.5)3.5 mL，匀浆5 min。称取1 g浆液于10 mL离心管中，加入10，20，50 μL LMG-乙醇溶液(100 μg/L)，再加入一定量乙腈，超声混匀，离心(4500 r/min)10 min，收集上清液，重复提取一次，合并上清液。将提取液吹干，用1 mLV(无水乙醇)∶V(水)=3∶1混合溶液复溶，用建立的仿生ELISA法测定样品中LMG的回收率。

2 结果与讨论

2.1 96微孔板的羟基化预处理

常用的聚苯乙烯微孔板具有很强的惰性和疏水性，用过硫酸铵水相热分解，可以氧化聚苯乙烯表面，使其出现氧空位，继而吸收空气水分，从而出现表面羟基，使得表面羟基增多，以达到亲水改性的目的，有利于多巴胺表面聚合制备分子印迹膜。

2.2 LMG-MIPs合成条件的优化

2.2.1 模板分子和DA的质量比对目标物吸附性能的影响

模板分子LMG和DA的质量比将影响MIPs膜对目标分子的吸附性能。实验以LMG为目标物，用建立的仿生ELISA法考察了LMG和DA的质量比分别为1∶5，1∶10，1∶15，1∶20时，LMG-MIP膜对目标物的吸附性能，结果如图1所示。由图1可以看出，当LMG和DA的质量比为1∶5时，由于DA的量较少，微孔板上形成的位点较少。而当DA的量过大时，虽然吸附量会增加，但由于聚合程度高形成的MIP膜颜色较深而产生干扰，且由于形成的MIP膜厚导致LMG模板分子不易被洗脱，造成假阳性。因此，本实验选择LMG和DA质量比为1∶10。

2.2.2 聚合时间对MIPs膜吸附性能的影响

DA的氧化自聚合时间对MIP膜的厚度也产生较大影响，如聚合时间不够，则形成有效的孔穴结构少，从而影响MIP对目标物的吸附。而聚合时间过长，则导致MIP膜太厚。实验考察了聚合时间分别为2，4，6，8 h 对MIPs膜吸附性能的影响，结果如图2所示。

由图2可见，当聚合时间为2 h，因微孔板上结合位点少，对LMG的检测灵敏度低。而当聚合时间延长至6，8 h时，微孔板MIP膜的吸光度值在0.6～1.1，此时微孔板颜色较深，干扰较严重(如图2b)。当聚合时间为4 h时，微孔板的膜厚适当，干扰小，LMG-MIP膜微孔板在492 nm处的吸光度值(0.06±0.006)与空白板(0.05±0.005)相近，因此采用的聚合时间为4 h。

2.3 扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)形貌表征

将96孔板的合成原料聚苯乙烯板切成1 cm×1 cm的方块，分别在其表面制备MIPs膜和NIPs膜，对空白聚苯乙烯板、MIPs膜和NIPs膜进行SEM表征，结果见图3。图3分别是96孔板上空白微孔板(图3a)、MIP膜(图3b)和NIP膜(图3c)的SEM图。由图3可以看出， MIPs膜和NIPs膜平铺于96孔板中，形貌平整。但MIPs膜与NIPs膜相比有一定的褶皱，这可能是由于聚合时加入了LMG，之后又被洗脱出去的缘故。

2.4 酶标抗原的表征分析

由图4可以看出，羧基化的LMG在230，319，426 nm处有吸收峰，HRP在285，403 nm处有吸收峰，而酶标抗原LMG-HRP在226，319，426 nm处有吸收峰， HRP在403 nm处的吸收峰偶联后消失了，而羧基化LMG在319，426 nm处的吸收峰在偶联后也明显减弱，说明LMG-HPR的偶联反应已经发生。

2.5 仿生ELISA标准曲线

在优化的实验条件下(模板分子和多巴胺的质量比为1∶10，聚合时间为4 h) ，建立了LMG仿生ELISA方法的标准工作曲线(见图5)，线性方程为y=-10.932x+57.805，相关系数r=0.9953。实验以IC50值表示方法的灵敏度，IC85表示最低检出限[10,18]。由曲线可知，LMG的IC50值为5.18 μg/L，最低检出限为0.03 μg/L。

2.6 选择性

实验选取LMG的两种结构类似物LCV和MG进行方法的选择性试验。由表1可知，所制备的MIP膜对LCV和MG的CR较低，分别为4.2%和21.3%，说明微孔板LMG-MIP膜在仿生ELISA竞争反应中对LMG有较好的特异识别能力。

2.7 样品加标回收率

为了验证微孔板LMG-MIP膜作为仿生抗体所建立的ELISA方法的有效性，用实际鱼肉进行加标回收实验，结果如表2所示。

由表2可见，回收率为71.8%～73.5%，RSD≤4.2%。可见，本文所建立的仿生ELISA法能直接检测鱼肉样品中的LMG残留量，方法简便快速，可用于水产品中LMG的快速筛查。

表1 LMG及其类似物的IC50和CRTab.1 IC50 values and CR ofLMG and its analogues交叉反应物Competitive compoundIC50/(μg·L-1)CR/%隐性孔雀石绿LMG5.0100隐性结晶紫LCV120.24.2孔雀石绿MG23.521.3表2 样品LMG的加标回收测定结果(n=3)Tab.2 Recoveries of LMG in weever by ELISA(n=3)样品Sampleρ(LMG)/(μg·kg-1)ELISA测定值Measured values/(μg·kg-1)回收率Recoveriesrate/%相对标准偏差RSD/%鲈鱼Weever10.72±0.0372.34.221.44±0.0571.83.553.68±0.1573.54.1

3 结论

以LMG为模板分子，利用DA氧化自聚合在羟基化的微孔板表面制备分子印迹膜，以此MIP膜作为仿生抗体，建立了LMG仿生ELISA检测方法。方法的检出限达到0.03 μg/L，对LCV和MG的交叉反应率分别为4.2%和21.3%。将所建立的方法应用于鱼肉样品中LMG的检测，加标回收率为71.8～73.5%，RSD≤4.2%。