马明坤，袁 亮，张水勤，李燕婷，高 强，赵秉强*

（1 吉林农业大学资源与环境学院，吉林长春 130118；2 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/农业农村部植物营养与肥料重点实验室，北京 100081）

腐殖酸(humic acid)是动植物残体和微生物通过物理、化学和生物作用形成的富含羧基、羟基、烷基等多种官能团的天然有机高分子化合物的混合物[1-2]，广泛存在于土壤、水、沉积物和煤炭中[1,3]。腐殖酸对氮磷肥具有增效调控作用，可提高植物的根系活力，促进植物对养分的吸收利用，提高肥料利用效率，改善作物产量和品质[4-9]。

腐殖酸具有的生物活性与其羧基含量有较高的相关性[10-11]。相关研究表明，腐殖酸羧基含量与吲哚乙酸(IAA)含量之间存在正相关关系[10]。玉米经富含羧基的腐殖酸浸种后，可显著提高其囊泡的根系和质子泵活性[12]。腐殖酸中的羧基可与尿素分子形成大量的氢键或络合配位键，从而实现腐殖酸对尿素释放的调控[13]；腐殖酸结构中的羧基可与磷酸根竞争土壤胶体表面的吸附位点，减少土壤对磷的吸附[14]。

对腐殖酸进行物理(机械研磨、超声波)，化学(过氧化氢、硝酸氧化等)和生物(发酵处理等)等方法处理，可改变腐殖酸的结构和羧基官能团含量。机械研磨可提高腐殖酸提取率1.9～2.5倍，但对腐殖酸羧基含量改变程度弱[15-16]；超声波的“声化学”作用会使水的氢原子和羟基自由基热解离，在氧气或空气条件下，氢原子会被氧气捕捉变成HO2·，生成氧气和过氧化氢，这些氧自由基可以增加腐殖酸羧基的数量，但改变程度弱[17]。微生物处理可使腐殖酸具有更高的含氧及含氮官能团，使其分子量变小、絮凝极限增大[18]，但处理周期较长。化学氧化是增加含氧官能团最直接的方式。高锰酸钾氧化使腐殖酸生成大量无机物质[19]；硝酸氧化生成的硝基和亚硝基以及新生态氧可使腐殖酸生成羧基，且硝基和亚硝基会取代芳香环[20-21]；过氧化氢在反应过程中生成HO2·、、HO·等氧自由基，这些氧自由基可以破坏腐殖酸芳环结构，使芳香单元断裂[22]，增加羧基的数量。相关研究表明[23]，在反应条件为过氧化氢浓度20%、液固比1∶1、反应时间12 h时，可提高腐殖酸羧基含量70%；在反应条件为过氧化氢浓度15%、液固比0.6∶1、反应时间210 min时，可显著提高腐殖酸羧基含量[24]。上述有关过氧化氢氧化腐殖酸的研究中，反应参数从反应时间、过氧化氢溶液浓度、液固比等具体参数上差异较大，缺少不同pH条件下过氧化氢氧化对腐殖酸羧基影响的研究。

本文通过响应面设计优化过氧化氢对腐殖酸氧化的反应条件，筛选可提高腐殖酸羧基含量的方法，并建立过氧化氢反应条件和腐殖酸羧基含量的关系式，以期为创制富含羧基的腐殖酸材料提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 腐殖酸材料制备

供试腐殖酸材料为以风化煤为原料生产的腐殖酸钠(产自内蒙古乌海)[1]，其碳、氢、氮和氧元素含量分别为62.99%、3.75%、1.34%和31.92%，羧基峰面积为1.45，pH为10.23。

1.2 单因素试验设计

以腐殖酸为材料，以6%过氧化氢溶液为氧化反应液，反应温度为100℃。试验一，反应液固比0.4∶1，反应时间为120 min，设置pH分别为1、4、7和10，考察不同pH条件下氧化对腐殖酸羧基含量的影响；试验二，pH为7，液固比为0.4∶1，设置反应时间分别为60、120、180和240 min，研究反应时间对腐殖酸羧基含量的影响；试验三，pH为7，反应时间为120 min，设置反应液固比分别为0.2∶1、0.4∶1、0.6∶1和0.8∶1，考察反应液固比对腐殖酸羧基含量的影响。试验处理重复3次。

1.3 响应曲面优化试验设计

在单因素试验的基础上，根据响应面Box-Behnken设计原理，选取pH(X1)、反应时间(X2)、液固比(X3)共3个对腐殖酸羧基含量影响显著的因子，以腐殖酸羧基含量为响应值，采用3因子3水平的响应面分析法，得到二次回归方程，并找出最佳反应参数。试验设计如表1。

表1 Box-Behnken 响应面设计试验因子与水平Table 1 Variables and levels in response surface design of Box-Behnken

1.4 样品羧基官能团的测定

将不同反应条件下得到的腐殖酸材料60℃烘干后，称取约2 mg和200 mg光谱纯溴化钾压片，通过650FTIR傅里叶红外变换光谱仪(港东，中国天津)进行红外光谱测定，每个样品扫描32次，分辨率为4 cm-1。使用OMNIC9.0软件进行基线校正和数据平滑校正，使用Origin 2018软件对1700 cm-1～1692 cm-1波数范围内的腐植酸羧基峰面积进行积分[25]，用所得数值表示腐殖酸羧基含量[26-27]。并使用Origin 2018软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同氧化反应参数对腐殖酸羧基含量的影响

2.1.1 pH 由表2可以看出，氧化腐殖酸的羧基含量随着pH的升高呈先下降、后上升、再下降的趋势。当pH为1和7时，腐殖酸羧基含量较高，分别为3.73和4.24，较未氧化腐殖酸(HA)的羧基含量(1.45)分别显著提高了157%和192%；pH为4和10时，腐殖酸羧基含量较低，分别为2.17和1.56，增幅下降到49.9%和7.8%。其中，pH为10时的羧基含量与HA未达到显著性差异水平。在低pH条件下(pH为1)，溶液中含有大量的H+，这为羧基的形成提供了可能，致使氧化腐殖酸的羧基含量较高；当pH逐渐上升时(pH为4)，溶液中H+逐渐减少，从而导致生成的羧基含量减少；但当pH进一步提高至7时，过氧化氢还会生成、HO·和更多的HO2·[28]，从而使过氧化氢具有更高的氧化性，使氧化腐殖酸具有较高的羧基含量；当pH为10时，过量的氧自由基与生成的羧基，使羧基含量降低。

2.1.2 反应时间 由表2可知，随着反应时间的延长，腐殖酸羧基含量呈先升高后降低的趋势。当反应时间由60 min上升到120 min时，腐殖酸羧基含量达到最大值，此后随着反应时间的延长羧基逐渐下降。与未处理腐殖酸(HA)羧基含量(1.45)相比，反应时间为60、120、180和240 min时腐殖酸羧基含量分别提高了15.9%、192.2%、83.0%和48.5%。其中，反应时间为120和180 min时，腐殖酸羧基含量与HA达到了显著性差异水平。过氧化氢可将腐殖酸中的芳香环氧化成羧基，随着反应时间的延长，过氧化氢可与已生成的羧基反应，导致羧基含量下降。

2.1.3 液固比 由表2发现，随着液固比的增大，腐殖酸羧基含量呈现先升高、再降低、最后升高的趋势。在液固比为0.2∶1、0.4∶1、0.6∶1、0.8∶1条件下氧化，腐殖酸的羧基含量分别为2.00、4.24、2.30和2.46，比未处理腐殖酸(HA)羧基含量(1.45)分别显著提高44.8%、192.2%、58.6%和69.9%。当液固比较低(0.4∶1)时，少量的过氧化氢可使腐殖酸中生成羧基，而当液固比升高时(0.6∶1、0.8∶1)，过氧化氢与生成的羧基反应，导致羧基含量下降。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 二次响应面回归模型的建立与分析 依据单因素试验，响应面优化选择了3个供试参数水平，pH为4、7和10，反应时间为60、120和180 min，液固比为0.2∶1、0.4∶1和0.6∶1，3个因素的3个水平依次归化为-1、0、1，具体参数组合见表3。表3中1～12号是析因试验，13～15号是中心试验。15个试验点为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在X1、X2和X3所构成的三维顶点；零点为区域的中心点，零点试验重复3次，用以估计试验误差。

应用Design Expert进行回归拟合分析，可得到反应条件与腐殖酸羧基含量之间的二次多项式模型为：Y=4.24+0.31X1-0.084X2-0.15X3-0.31X1X2+0.23X1X3+0.33X2X3-0.97X12-0.92X22-1.00X32。式中，Y为腐殖酸羧基含量的预测值；X1、X2和X3分别代表pH、反应时间和反应液固比的编码值。

由表4可知，回归模型具有较高的显著性(P＜0.01)，失拟性不具有显著性(P=0.2202＞0.05)，R2=0.9675，RAdj2=0.9089，说明方程对试验拟合较好。回归方程各方差分析结果表明，因子X1对腐殖酸羧基含量有显著影响(P＜0.05)，平方因子X12、X22、X32对腐殖酸羧基含量有极显著影响(P＜0.01)，因子X2、X3及各因子交互(X1X2、X1X3、X2X3)对腐殖酸羧基含量影响不显著(P＞0.05)。各因子对腐殖酸羧基含量的影响依次是X1(pH)＞X3(液固比)＞X2(反应时间)。

表3 响应面试验设计与结果Table 3 Response surface experimental design and results

2.2.2 两因子间交互作用分析 响应面分析见图1A、图1B和图1C。各图是由响应值和各试验因子构成的立体曲面图，显示了pH、反应时间和液固比中任意一个变量取零水平时，其余两个变量对腐殖酸羧基含量的影响。

图1A显示反应时间为120 min，pH与液固比对腐殖酸羧基含量的交互作用。可知，当pH一定时，腐殖酸羧基的含量随着液固比的升高呈现先升高后降低的趋势。当液固比一定时，随着pH的升高，腐殖酸羧基含量呈现先升高后降低的趋势。

图1B为液固比0.4∶1时，pH与反应时间对腐殖酸羧基含量的交互作用。可知，当pH一定时，随着反应时间的延长，腐殖酸羧基含量升高，但时间超过一定值时，腐殖酸羧基含量呈下降趋势。当反应时间一定时，随着pH的升高，腐殖酸羧基含量先升高后降低。由其等高线为圆形可知两者交互作用不显著。

图1C显示pH为7时，反应时间与液固比对腐殖酸羧基的交互作用。当反应时间一定时，随着液固比的提高，腐殖酸羧基含量呈现先升高后降低的趋势。当液固比一定时，腐殖酸羧基含量也呈现先升高后降低的趋势。

表4 回归方程系数显著性检验结果Table 4 Test results of significance for regression equation coefficients

图1 任意两变量对腐殖酸羧基峰面积影响的响应曲面图Fig.1 Response surface plots for the effects of any two variables on the peak area of humic acid carboxyl group

2.2.3 最佳条件的预测 通过回归模型的预测，得到在本试验以过氧化氢为氧化剂，在反应温度为100℃条件下，提高腐殖酸羧基含量的最佳反应条件为pH值为7.49、反应时间为114.84 min、液固比为0.39∶1，此时腐殖酸羧基含量达到最大值4.27，比未氧化腐殖酸(HA)羧基含量(1.45)提高194.5%。通过对回归模型预测过氧化氢氧化提高腐殖酸羧基含量的最佳反应条件进行验证，得到最佳反应条件下腐殖酸羧基含量平均为4.21，与理论值4.27误差仅为1.4%，证实了该模型的有效性。

3 讨论

腐殖酸羧基含量与其生物活性有关，而氧化处理是增加羧基含量的重要方式。本研究通过使用响应面法试验设计，克服了正交设计只能处理离散的水平值，而无法找出整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值的缺陷，并能减少试验次数，分析几个因素的交互作用，以达到全面地反映各因素水平的效果[29-31]。相关研究表明，在反应条件为过氧化氢浓度15%、液固比0.6∶1、反应时间210 min时，可显著提高腐殖酸羧基含量[24]；在反应条件为过氧化氢浓度20%、液固比1.0∶1、反应时间12 h时，可提高腐殖酸羧基含量70%[23]。然而，本文通过响应面设计试验得到的预测值可提高腐殖酸羧基含量194.5%，其原因可能是过氧化氢在反应过程中释放的等氧自由基可与腐殖酸反应，其先将腐殖酸芳环结构破坏[22]，再将芳环上的甲基氧化成醛基，进而氧化成羧基[19]，从而提高腐殖酸羧基含量。本研究大幅度提高腐殖酸羧基含量，可能是因为pH对腐殖酸羧基含量的影响要大于过氧化氢浓度、液固比和反应时间，同时，本文通过响应面优化设计，得到了提高腐殖酸羧基的最佳反应条件。

通过本文可以发现，在pH变量取零水平时，并固定其余两个变量中任意一个时，随着时间或液固比变量的增加或减少，腐殖酸羧基含量均是呈现先上升后下降的趋势。其原因可能是腐殖酸作为天然的有机大分子混合物，其结构中既含有大分子量结构又含有小分子量结构。当过氧化氢与腐殖酸反应时，过氧化氢的氧自由基可能优先氧化结构中的大分子物质，导致腐殖酸的羧基含量呈现上升趋势。随着液固比或时间逐渐增加，并达到一定值时，溶液中的过氧化氢就开始与结构中的小分子物质或刚生成的羧基反应，并将其氧化，从而导致腐殖酸羧基含量呈现下降的趋势。

当反应时间或液固比中任意一个变量取零水平，并固定反应时间或液固比中另外一个变量时，腐殖酸羧基含量总是随着pH的升高呈现先升高后降低的趋势，并在pH为7时达到最大值后逐渐下降。可能原因是过氧化氢会生成更多的和HO2·氧自由基[28]，这些氧自由基使过氧化氢具有更高的氧化性，从而可以更完全的氧化腐殖酸，增加腐殖酸羧基含量。当反应条件达到pH为10时，羧基含量呈现下降趋势，其原因一方面是因为碱性条件下，反应液中的碱性离子会与生成的羧基反应，造成羧基含量的下降；另一方面是因为反应液中存在的过量氧自由基在与腐殖酸反应生成羧基的同时，还会与新生成的羧基反应，使新生成的羧基被氧化，从而造成羧基含量呈现下降的趋势。

4 结论

采用过氧化氢氧化腐殖酸提高羧基含量，在单因素试验基础上，通过响应面Box-Behnken试验设计，建立了腐殖酸羧基含量的二次多项式数学模型：Y=4.24+0.31X1-0.084X2-0.15X3-0.31 X1X2+0.23X1X3+0.33X2X3-0.97X12-0.92X22-1.00X32(式中，Y为腐殖酸羧基含量的预测值；X1、X2、X3分别代表反应pH、反应时间、反应液固比的编码值)。在该试验条件下，优化出过氧化氢氧化腐殖酸提高腐殖酸羧基含量的最佳反应条件为pH 7.49、反应时间为114.84 min、液固比为0.39∶1。在该条件下得到的实际值为4.21，所得值与模型预测值4.27高度相符。