李文谦，施凯楠，朱星扬，茅燕勇

（淮阴工学院，江苏淮安223003）

磷是作物产量形成和品质保证的重要因素，影响着世界上很多国家的农业发展[1,2]。只有那些溶解在水中的磷，才能被植物吸收利用，而在土壤栽培过程中由于磷的吸附和固定作用的存在，使得磷化肥的被作物利用的效率非常低，产生了一系列资源浪费问题[3-5]。在土壤磷元素转化过程中，通过使用解磷微生物来溶解磷矿粉产生可溶磷，在目前看来能够改善磷元素缺乏地区作物生长情况，同时能够合理利用我国现有的磷矿资源，以减少资源浪费的情况，保持了土壤的肥沃性，还能达到节能减排的目的[6-8]。

我国的磷矿资源虽然丰富，但在品质上却以产出中低品位磷矿粉为主[9,10]，充分利用这些中低品位的磷矿粉，将其中的磷元素释放出来，对我国磷矿资源的利用具有重要的意义。为此，本文以实验室筛选自果园的解磷菌作为研究对象，通过试验确定解磷菌对中低品位磷矿粉的最佳溶解工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和磷矿粉

菌株PR17为实验室筛选的解磷真菌。

中低品位磷矿粉，购买自济南荣冠化工有限公司。

1.1.2 培养基

PDA固体培养基：马铃薯 200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20 g、水 1000 mL。

PDA液体培养基：马铃薯 200 g、葡萄糖20 g、水1000 mL。

1.2 方法

试验在装有50 mL PDA液体培养基的三角瓶中进行，同时加入0.25 g中低品位磷矿粉，作为培养基中的磷源，将分离的细胞悬液按培养基液体体积比的10%接种到每个三角瓶中。紧接着放入高压蒸汽灭菌锅中，在115℃、0.1 MPa下，灭菌20 min。然后放入28℃的恒温摇床中，把振荡速率调成180 r/min培养5 d。最后取样，测定培养基液体中可溶性磷的含量。试验重复3次。

1.2.1 培养时间对解磷菌溶磷能力的影响

设置7个初始条件全部相同的平行样，分别于第1、2、3、4、5、6、7 d 取样，测定培养液中可溶性磷含量。

1.2.2 初始pH对解磷菌溶磷能力的影响

通过调节磷矿粉培养基的初始pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0和7.5，在接种后的第5 d进行取样，测定培养基中可溶性磷的含量、解磷菌菌体湿重。

1.2.3 培养温度对解磷菌溶磷能力的影响

将解磷菌株溶解磷矿粉时摇床培养温度设定为20、23、25、28、31 ℃，在接种后第 5 d进行取样，测定培养基中可溶性磷的含量、解磷菌菌体湿重。

1.2.4 接种量对解磷菌溶磷能力的影响

将解磷菌株按照接种量体积的1%、3%、5%、7%和10%接种到磷矿粉培养基中进行培养，在接种后的第5 d对培养基进行取样，测定培养基中可溶性磷的含量、解磷菌菌体湿重。

1.2.5 振荡速率对解磷菌溶磷能力的影响

将解磷菌株溶解磷矿粉时摇床振荡速率设定为120、140、160、180、200 r/min，在接种后的第 5 d 进行取样，测定培养基中可溶性磷的含量、解磷菌菌体湿重。

1.2.6 磷矿粉浓度对解磷菌溶磷能力的影响

将解磷菌株溶解磷矿粉时的磷矿粉浓度分别设置为3.5、4、4.5、5、5.5g/L，在接种后的第 5 d 进行取样，测定培养基中可溶性磷的含量、解磷菌菌体湿重。

1.2.7 碳氮比对解磷菌溶磷能力的影响

将解磷菌株溶解磷矿粉时的培养基溶液里的碳氮比分别设置为10:1、20:1、30:1、40:1和50:1，在接种后的第5 d对培养基液体进行取样，测定培养基中可溶性磷的含量、解磷菌菌体湿重。

1.3 测量指标与方法

1.3.1 培养液中可溶性磷含量的测定

打开紫外分光光度计，调节好待测波长后，预热30 min待用。将培养了5 d的三角瓶从摇床中取出，先将培养液过滤（使用无磷滤纸以减少实验误差），然后将过滤后得到的液体在10000 r/min、4℃下离心20 min，取出后吸取10 mL上清液，再次通过0.22 μm的微孔滤膜，取5 mL透过微孔滤膜后的液体，加入50 mL的容量瓶中，补加去离子水至35 mL，然后缓缓加入酚酞指示剂1～2滴，用0.1 mol/L浓度的NaOH溶液中和至待测液体刚出现微红色，再精确加入10 mL钼锑抗显色剂[11]，摇匀定容后，静置30 min，之后在700 nm波长的紫外分光光度计上，用1 cm光径比色皿进行比色（调节分光光度计的时候，以空白对照组的吸收值作为比色零点）。

1.3.2 解磷菌菌体湿重的测定

为考察菌体生长与培养液中可溶性磷含量的相关关系，在方法1.2.1～1.2.7中测定可溶性磷含量的同时测定菌体湿重。取100 mL培养液，在5000 r/min、4℃下离心10 min，弃上清，称量湿菌湿重。

2 结果与分析

2.1 培养时间对解磷菌溶解中低品位磷矿粉的影响

接种解磷菌悬液之后，放入摇床培养。每天进行可溶性磷含量的检测，结果如图1。

由图1可知，培养液中的可溶磷含量在培养第5 d达到最大值，为25.8 mg/L，说明磷矿粉达到了最大的溶解量，此时菌体生长量也最大，菌体湿重为85 g/L。因此，解磷菌溶解中低品位磷矿粉的最佳培养时间为5 d。

图1 培养时间对解磷菌溶解中低品位磷矿粉的影响Fig.1 Effect of culture time on dissolution of medium and low-grade rock phosphate by phosphate-solubilizing bacteria

2.2 初始pH对解磷菌溶解中低品位磷矿粉的影响

分别于培养基的初始 pH 5.5、6.0、6.5、7.0 和 7.5 条件下培养5 d，对含磷矿粉的培养液进行可溶性磷含量的检测，试验结果如图2所示。

图2 初始pH对对解磷菌溶解中低品位磷矿粉的影响Fig.2 Effect of initial pH on dissolution of medium and lowgrade rock phosphate by phosphate-solubilizing bacteria

由图2可知，菌体生长量与可溶性磷含量的变化趋势一致，均为先上升后下降。在pH 6.5时，菌体的溶磷效果最好，培养液中可溶磷含量达到最大值，为28.3 mg/L。这主要因为解磷菌生长和繁殖的时候，培养基中液体的pH值对其影响比较大，而在液体pH高于或低于菌体的最适pH的时候，都会对菌体生长产生较大的影响，所以培养基的最适pH为6.5。

2.3 培养温度对解磷菌溶解中低品位磷矿粉的影响

分别于 20、23、25、28、31 ℃的恒温培养摇床中进行5 d培养，检测可溶性磷含量，试验结果如图3所示。

图3 培养温度对解磷菌溶解中低品位磷矿粉的影响Fig.3 Effect of culture temperature on dissolution of medium and low-grade rock phosphate by phosphatesolubilizing bacteria

由图3可见，在28℃条件下，培养液中的可溶性磷含量达到了最大值，为29.6 mg/L，高于或低于这个温度，培养液中的可溶性磷含量都会显著降低；同时在此温度下，菌体生长量也达到了最大值。说明培养菌体时的环境温度对菌体生长和繁殖的影响比较大，当环境温度高出最适温度或者低于最适温度的时候，菌体生长都会受到影响。所以，菌体溶解磷矿粉最适温度为28℃。

2.4 接种量对解磷菌溶解中低品位磷矿粉的影响

采用1%、3%、5%、7%和10%的接种量培养5 d，试验结果见图4。

由图4可见，当接种量为7%时，可溶性磷含量达到最大值，为31.3 mg/L，当接种量低于这个值时，液体中的可溶性磷含量呈上升趋势，但当接种量大于这个值时，液体中的可溶磷含量下降。同时，菌体生长量在低于最适接种量时，呈明显上升趋势；当接种量超过最适值的时候，菌体生长量便趋于平缓，这可能是因为接种量过大的情况下，培养基中的营养物质不足，导致解磷效果下降。因此，最适接种量为7%。

图4 接种量对解磷菌溶解中低品位磷矿粉的影响Fig.4 Effect of inoculating amount on dissolution of medium and low-grade rock phosphate by phosphate-solubilizing bacteria

2.5 振荡速率对解磷菌溶解中低品位磷矿粉的影响

分别于 120、140、160、180、200 r/min 条件下培养 5 d，检测可溶性磷含量，试验结果如图5所示。

图5 振荡速率对解磷菌溶解中低品位磷矿粉的影响Fig.5 Effect of shaking speed on dissolution of medium and low-grade rock phosphate by phosphate-solubilizing bacteria

由图5可知，在速率为120～180 r/min时，培养液中的可溶性磷含量呈明显上升趋势，在振荡速率为180 r/min条件下，达到最大值27.8 mg/L，超过180 r/min的速率时，液体中可溶磷性含量又明显降低。同时，菌体生长量也在180 r/min的速率下达到最大值，高于或低于这个转速，都会对菌体生长和繁殖有较大影响。分析其主要原因，可能是由于振荡速率太高的情况下，摇床高速振荡产生过高的剪切力削弱了菌体的生长，减少了解磷菌的菌体数量，并降低了解磷菌的溶磷能力。因此，确定最佳振荡速率为180 r/min。

2.6 磷矿粉浓度对解磷菌溶解中低品位磷矿粉的影响

在磷矿粉浓度分别为 3.5、4、4.5、5、5.5 g/L 条件下培养解磷菌，试验结果如图6所示。

图6 不同磷矿粉浓度对解磷菌溶解中低品位磷矿粉的影响Fig.6 Effect of concentration of phosphate rock powder on dissolution of medium and low-grade rock phosphate by phosphate-solubilizing bacteria

由图6可以看出，当培养基磷矿粉浓度为5 g/L时，发酵液中可溶性磷含量达到最大值，为30.5 mg/L，同时菌体生长量也达到最大值。当培养基中磷矿粉浓度为3.5～5.5 g/L时，液体中可溶性磷含量和菌体生长量都呈明显上升趋势，但当磷矿粉浓度超过5 g/L时，可溶性磷的含量随着磷矿粉浓度的增加而明显减少。分析其原因，可能是由于本实验使用的是中低品位磷矿粉，较之质量高的磷矿粉，含有较多的杂质，包含一些金属离子等，这些杂质又使液体中的可溶性磷沉淀。因此，最佳的磷矿粉浓度为5 g/L。

2.7 碳氮比对解磷菌溶解中低品位磷矿粉的影响

在碳氮比分别为 10:1、20:1、30:1、40:1、50:1 条件下进行培养，结果如图7所示。

由图7可知，在碳氮比为20:1条件下，培养液中的可溶性磷含量达到最大值，为28.8 mg/L，同时，菌体生长量也达到最大值。但是当碳氮比低于或高于最适碳氮比时，培养液中的可溶性磷含量和菌体生长量都呈明显下降趋势。培养基中营养物质浓度合适时，解磷菌才能较好的生长和繁殖，营养物质浓度过低时不能满足解磷菌正常的生长需要，浓度过高时则可能对解磷菌生长起抑制作用。

图7 碳氮比对解磷菌溶解中低品位磷矿粉的影响Fig.7 Effect of carbon-nitrogen ratio on dissolution of medium and low-grade rock phosphate by phosphatesolubilizing bacteria

3 结论

通过控制外部条件因素（培养时间、初始pH、培养温度、接种量、振荡速率磷矿粉浓度、碳氮比），研究不同条件下，解磷菌对中低品位磷矿粉的溶解效果，从而确定解磷菌对中低品位磷矿粉的最佳溶解工艺条件，即最适初始pH为6.5，最适培养温度为 28℃，最适接种量为7%，最适振荡速率为180 r/min，最适磷矿粉浓度为5.0 g/L，最适碳氮比为20:1，培养5 d。通过使用解磷菌来溶解磷矿粉产生可溶磷，在目前看来能够改善磷元素缺乏地区作物生长情况，提高作物的产量。同时能够合理利用我国现有的磷矿资源，保持土壤的肥沃性。这对于高效利用我国现有的磷矿资源具有非常深远的意义。