周婵媛， 李晓焕， 王 壹， 杨秀群， 杜 超， 严 伟

(贵阳学院化学与材料工程学院，贵州贵阳 550005)

蛋白质是维持生命活动的重要基础，因此，对蛋白质的分离富集是分离科学的一个重要研究领域。然而生物样品基体复杂，待测物含量低，需经分离富集后才能进行检测。在线固相萃取技术具有操作简单、易实现样品无溶剂(或少溶剂)处理、准确度和灵敏度高、节省时间等优点。但目前用于蛋白质萃取介质的种类有限,因此开发具有高萃取效率和高选择性的萃取介质对提高蛋白质分离效果具有重要的意义。

碳纳米管为一维纳米材料，表面有丰富的π电子，疏水性强，具有良好的化学稳定性、热稳定性和高比表面积等优点，在固相萃取方面得到广泛应用[5 - 8]。近年来，碳纳米管在蛋白质分离富集方面引起广大研究者的极大兴趣与关注[9 - 14]。然而，以碳纳米管作为在线固相萃取的吸附剂时，非常细小的碳纳米管常常会发生团聚，导致其有效比表面积明显降低，从而大大降低系统的吸附容量[15]。为此，研究者们将碳纳米管材料负载到不同的刚性基底表面以提高吸附效率，如玻璃基体、SiO2或聚合物整体柱[16 - 18]等。Du等[19]通过该方法成功制备了MWNTs/SiO2复合微球，将聚合物包覆在硅胶表面，实现了对细胞色素c的分离富集。石英棉(QW)具有高比表面积和高电荷密度等特性，在对金属离子、有机污染物的吸附，生物大分子和细胞的分离领域已有广泛的应用[21 - 22]。本文采用层层自组装法将羧基化多壁碳纳米管(c -MWNTs)负载于QW表面，制备c -MWNTs/QW在线固相萃取柱，以血红蛋白(Hb)和溶菌酶(Lyz)作为模型蛋白，将c -MWNTs/QW固相萃取柱与顺序注射系统联用，实现了从复杂生物基体中分离富集碱性蛋白。本课题组在前期研究中制备了poly(MMA-EDMA-MWCNT)复合整体柱[20]。因MWNTs的加入增大了整体柱的比表面积，从而提高了对蛋白质分离富集能力。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

FIAlab-3000顺序注射系统(美国，FIAlab Instruments)；T6紫外/可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；DYCZ-28A垂直式电泳槽(北京市六一仪器厂)；Orion 868型酸度计(美国，ThermoElectron公司)；IR-prespige-21傅立叶红外光谱仪(日本，岛津公司)；电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。

溶菌酶(Lyz，14.4 kDa)、牛血红蛋白(Hb，15.5 kDa)(美国Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，68 kDa)(上海卓康生物科技有限公司))；聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDDA，Mw=400～500 kDa)(美国Sigma公司)；聚苯乙烯磺酸钠(PSS，Mw=70 kDa)(美国Sigma公司)；多壁碳纳米管(MWCNTs，深圳市纳米港有限公司)；乙醇、H2SO4、HNO3、NaCl、NaH2PO4·2H2O、K2HPO4·3H2O均为分析纯，购自天津博迪化工有限公司。其他试剂均为分析纯，实验用水均为Millipore纯水系统制备。

1.2 c -MWCNTs/QW固相萃取柱的制备

1.2.1c-MWCNTs制备c -MWCNTs根据文献方法[23]制备。称取110 mg MWCNTs于50 mL 50%乙醇溶液中，搅拌10 min，用超纯水抽滤清洗MWCNTs。过滤后置于60 mL浓H2SO4-HNO3混酸(3∶1，V/V)中，于60 ℃水浴回流5 h。过滤，用超纯水洗涤至中性，过滤收集c -MWCNTs固体粉末，将其分散在0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=6.0)中平衡6 h，备用。

1.2.2QW预处理首先将QW浸泡在无水乙醇中30 min，取出后在室温下晾干，将干燥的QW立即放入15 mL浓H2SO4+5 mL H2O2混合溶液中，浸泡20 min，用超纯水彻底洗净，晒干。

1.2.3层层自组装法制备CNTs/QW固相萃取柱在聚酯板材制成的微填充柱(内径2.8 mm)的一端填充少量玻璃纤维后，将约30 mg QW填充入微柱中，并在另一端同样填充少量的玻璃纤维(有效柱长大约为5 mm)。随后将微柱联入顺序注射系统中，该系统包括一个5.0 mL的注射泵，一个6位选择阀，一台紫外/可见分光光度计和一个容量为5.0 mL的储液环。以50 μL/s的流速将1.0 mL 0.2% PDDA溶液吸入储液环，然后以5 μL/s的流速使其通过微柱后，以0.5 mL的超纯水冲洗微柱。随后将1.0 mL 0.2%的PSS溶液按照同样的步骤负载，重复操作2次。将含有8～10 mg c -MWCNTs的适量悬浊液(大约 500 μL)引入微柱中，重复洗脱3次除去未吸附的多余c -MWCNTs。随后将微柱联入顺序注射系统中以进行蛋白质的在线固相萃取。为便于评价包覆的碳纳米管对蛋白质萃取行为的影响，分别以未经表面修饰的QW和c -MWCNTs填充两个相似的微柱作为比较。

1.3 固相萃取蛋白质

将0.005 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=6.0)以5 μL/s的流速注入到c -MW CNTs/QW固相萃取柱中，平衡过夜。将3 000 μL样品溶液吸入储液环，以5 μL/s的流速经整体柱富集。用2.0 mL的超纯水冲洗整体柱。再依次吸入500 μL 0.005 mol/L的PBS(pH=11.0)作为洗脱剂2，2 000 μL超纯水和500 μL 0.005 mol/L的PBS(pH=8.0)作为洗脱剂1进入储液环。以20 μL/s的流速洗脱整体柱，其中洗脱剂1和洗脱剂2分别用于洗脱Hb和Lyz，洗脱液用紫外/可见分光光度计在280 nm处在线检测蛋白质浓度。实验过程中应避免流通池中进入气泡，由于空气会产生很高的紫外吸收峰，干扰蛋白质的吸收峰，所以连接一个三通，方便冲洗流通池。

2 结果与讨论

2.1 CNTs/QW固相萃取柱结构性能表征

如图1所示，干燥的c -MWNTs粉末团聚严重，而c -MWNTs/QW复合材料的c -MWNTs团聚效应明显减弱，说明将c -MWNTs负载到QW表面后，可以增大材料的比表面积，有利于c -MWNTs与目标物分子充分接触，从而有利于吸附效率的提高。

图1 c -MWNTs(A)、QW(B)和c -MWNTs/QW(C)的扫描电镜(SEM)图Fig.1 SEM images of c -MWNTs(A),QW(B) and c -MWNTs/QW(C)

图2 c -MWNTs(a)、QW(b)和c -MWNTs/QW(c)的红外(IR)光谱图Fig.2 IR spectra of c -MWNTs(a),QW(b) and c -MWNTs/QW(c)

红外光谱图如图2所示，在3 424 cm-1处均有较宽的吸收峰，为-O-H伸缩振动峰。图中c -MWCNTs(曲线a)的1 621 cm-1为-C=O的伸缩振动吸收峰，1 083 cm-1为-C-OH 的弯曲振动吸收峰，2 915 cm-1为-C-H伸缩振动吸收峰。此外，比较图QW(曲线b)和c -MWNTs/QW(曲线c)的红外光谱发现，c -MWCNTs的加入并没有新吸收峰生成，并且二者均在1 100～1 200 cm-1有Si-O-Si伸缩振动吸收峰，说明了是QW在c -MWNTs/QW的复合材料中占大部分质量。

2.2 固相萃取条件的优化

2.2.1介质pH及浓度的影响考察了进样介质PBS浓度在0.005～0.20 mol/L范围内c -MWNTs/QW固相萃取柱对Hb和Lyz萃取效率的影响。实验结果见图3A，当浓度低于0.025 mol/L时，Hb和Lyz都可以较好的吸附在c -MWNTs/QW固相萃取柱上，但随着浓度的增加，吸附效率明显降低。为使两种蛋白质都获得较高的吸附效果，后续实验中均采用浓度为0.005 mol/L的PBS(pH=6.0)作为载流。

实验采用pH=3.0～8.0的0.005 mol/L PBS配制10.0 μg/L的Hb和Lyz混合标准溶液，不同pH条件下c -MWNTs/QW对两种碱性蛋白的吸附效果如图3B所示。当pH=6.0时吸附效果最好，pH继续增加时，对Hb吸附量呈明显下降。后续实验中选取pH=6.0的PBS为介质。

2.2.2洗脱剂pH及体积的影响考察洗脱液pH值对蛋白质洗脱效果的影响。结果如图3C所示。可以看出，随着pH值增加，洗脱效果得到了明显提高。可能由于Hb和Lyz的等电点分别为7.0和10.7，当洗脱液pH值大于蛋白质的等电点时，碱性蛋白质与碳纳米管之间的静电作用力减弱，蛋白质容易从吸附剂上洗脱下来。后续实验中分别选择pH=8.0和pH=11.0的PBS作为Hb和Lyz的洗脱剂。

考察不同洗脱体积对洗脱效果的影响，结果如图3D所示。从图中可以看出，增加洗脱液的体积可以明显改善蛋白质的洗脱效果。当洗脱剂体积增加至300 μL时，洗脱效果没有明显增强，在保证洗脱完全的基础上，为了尽可能缩短操作时间和增加富集倍数，在后续实验中选择的洗脱剂体积为250 μL。

图3 萃取和洗脱条件对c -MWNTs/QW萃取效率的影响 Fig.3 Effect of extraction and elution conditions on the extraction efficiency of c -MWNTs/QW for proteins (A)concentration of eluent;(B)pH of medium;(C)pH of eluent;(D)volumn of eluent.

2.3 吸附容量研究

用0.005 mol/L PBS(pH=6.0)分别配制10 μ/mL的Hb和Lyz，考察达到萃取平衡所需体积及动态吸附容量。具体步骤：分别以经过0.45 μm的水相滤膜的10 μ/mL的Hb和Lyz的PBS作为流动相，以所制备的整体柱作为色谱柱，使蛋白质溶液不断流过整体柱直至吸附饱和。整体柱上吸附蛋白质的量mprotein根据公式[15]计算，萃取、洗脱后光度法测定，然后计算c -MWNTs/QW固相萃取柱对Hb和Lyz的吸附容量分别为36.1 μg/mg和28.3 μg/mg，而c -MWNTs固相萃取柱分别为10.2 μg/mg和8.5 μg/mg，QW固相萃取柱分别为0.80 μg/mg和0.92 μg/mg。

2.4 萃取机理研究

图5 蛋白质在c -MWNTs/QW固相萃取柱上的分离富集洗脱过程Fig.5 A typical operating process including sample loading and protein isolation from the sample matrix,with sequential elution of proteins by selection of elution conditions with Hb,Lyz and BSA as model proteins

图6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳谱图Fig.6 SDS-PAGE analysis of whole blood samples with and without treatment with c -MWNTs/QW Lane(M),protein marker;(A) lane 1,500 μg/mL Hb standard;lane 2,the 500-fold diluted whole blood after preconcentrated with c -MWNTs/QW.lane 3,whole blood samples without treatment(500-fold dilution).(B) lane 1,10-fold diluted egg-white solution;lane 2,350-fold diluted egg-white solution;lane 3,4 isolation of lysozyme from 350-fold diluted rude extractant;lane S,500 μg/mL Lyz standard.

以0.005 mol/L PBS(pH=6.0)为溶剂，分别配制10.0 μg/mL碱性蛋白质(Hb和NaCl)和酸性蛋白质BSA溶液，研究c -MWNTs/QW固相萃取柱对蛋白质的作用机理，结果如图5所示。c -MWNTs/QW固相萃取柱对BSA几乎不吸附，而对Hb和Lyz可以完全吸附，同时洗脱溶剂可以完全洗脱吸附在c -MWNTs/QW固相萃取柱上的Hb和Lyz，富集因子分别为18和28。这是由于碳纳米管的等电点为3.0，在水溶液中带负电荷，BSA(等电点为4.7)在水溶液中也带负电荷，与碳纳米管之间产生静电斥力；而Hb和Lyz的等电点分别是7.0和10.7，在水溶液中带正电荷，与碳纳米管之间产生静电引力，从而实现对Hb和Lyz的选择性吸附。若吸附过程由疏水作用支配，则Hb和Lyz必须在高离子强度或pH接近其pI值的溶液条件下发生吸附，这与实验结果不符。而且，c -MWNTs 表面含有大量羧基和羟基等亲水基团，使其呈现亲水性，因此c -MWNTs吸附蛋白质是基于静电相互作用。

测试了纯的QW、PDDA自组装的QW和c -MWNTs/QW对碱性蛋白质的吸附。结果表明，在中性水溶液中QW和c -MWNTs/QW均能吸附大量的碱性蛋白质，而PDDA包覆的QW则完全不能吸附碱性蛋白质。除此之外，洗脱液可以完全洗脱吸附在c -MWNTs/QW固相萃取柱上的碱性蛋白质，但却不能洗脱吸附在纯QW上的碱性蛋白质。这些现象表明，QW表面的负电荷已被正电荷的PDDA中和，而且表面的官能团也完全被c -MWNTs层包覆，因此，碱性蛋白质和包覆的c -MWNTs之间的相互作用力可以视为吸附碱性蛋白质的主要驱动力。

2.5 固相萃取柱应用研究

2.5.1萃取系统分析性能在最优实验条件下，用本方法分析Hb和Lyz，线性方程为：YHb=0.0171X-0.22,线性范围0.30～15.0 μg/mL，检出限为0.15 μg/mL;YLyz=0.0185X+0.043,线性范围0.50～10.0 μg/mL，检出限为0.08 μg/mL。采用10 μg/L标准溶液考察方法精密度(RSD)，Hb和Lyz的RSD分别为1.8%和0.6%，回收率分别为89.2%和90.2%。该方法准确可靠，能够满足复杂生物样品中蛋白质分析要求。

2.5.2实际样品的分析图6A为萃取全血中血红蛋白的电泳图，其中泳道3为未经系统预处理的500倍稀释的全血样品溶液，由于浓度低导致染色不明显。泳道2为500倍稀释的全血样品经过c -MWNTs/QW在线固相萃取后的洗脱液，除血红蛋白的条带外，其他条带(如66.4 kDa的血清白蛋白条带)的浓度都大大减弱了，表明该固相萃取系统可以有效地将全血样品中的血红蛋白与其他大部分的共存蛋白质分离。图6B为萃取鸡蛋清中溶菌酶前后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳谱图，其中泳道1、2分别为未经过系统预处理后5、350倍稀释的鸡蛋清样品，泳道3、4为经c -MWNTs/QW在线固相萃取350倍稀释的鸡蛋清样品，用洗脱剂2洗脱两次后的收集液。鸡蛋清粗提液经该萃取后，溶菌酶的条带清晰可见，而大部分干扰蛋白质被有效去除。以上结果证实了该系统处理实际生物样品的能力。

3 结论

本文通过层层自组装的方法制备了c -MWNTs/QW，以血红蛋白和溶菌酶作为对象，研究了c -MWNTs/QW固相萃取柱对蛋白质的吸附行为，并对从复杂基体样品中分离碱性蛋白质进行了初步研究。研究结果表明，c -MWNTs/QW固相萃取柱选择性富集分离碱性蛋白质，血红蛋白和溶菌酶的富集倍率分别可达18和28，吸附容量分别为36.1 μg/mg和28.3 μg/mg。