于颖 肖刚 陈晚华

摘 要 胶原蛋白是生物体内重要的组成部分，在生物医药、食品保健、化妆品和组织工程领域得到了广泛的应用。鱼皮胶原蛋白因来源广泛，且具有良好的生物性能，如低抗原性、可降解性以及高生物相容性等优势，已引起研究者的深入研究。本文介绍了鱼类胶原蛋白的提取工艺，探讨了鱼皮胶原蛋白的性质及其应用前景。

关键词 鱼皮 胶原蛋白 提取工艺

中图分类号：TQ464.7 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）03-0070-04

Study on the technology for the extraction of fish skin collagen

YU Ying*， XIAO Gang， CHEN Wanhua**

（Shanghai Haohai Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 201613， China）

ABSTRACT Collagen is an important component of the organisms and has been widely used in biomedical， food health， cosmetic and tissue engineering fields. Collagen from fish skin has been deeply studied due to its extensive sources and good biological properties， such as low antigenicity， high biocompatibility and biodegradability. In this paper， the technology for the preparation of collagen from fish skin was introduced and its properties and application prospects were discussed.

KEy WORDS fish skin； collagen； extraction technology

胶原蛋白是一种白色、不透明、无支链的纤维性蛋白质类高分子物质，以不溶性纤维形式存在于动物体的皮肤、骨骼、软骨、肌腱、韧带和血管中，对维持血管壁、皮肤弹性和软骨润滑度，支撑器官，保护机体，提高毛发亮度等都有重要作用[1]。胶原蛋白作为天然可降解聚合物，具有生物活性高、生物相容性好、降解速度适宜等优势，并且易加工生产，是目前理想的生物医学材料之一。在以往，胶原蛋白主要是从牛、猪等陆生哺乳动物的皮肤中获取[2]，由于疯牛病和口蹄疫等疾病的发生，使人们对陆生哺乳动物胶原蛋白及其制品的安全性产生质疑。再加上有些地区的习俗和宗教信仰等原因[3]，限制了陆生哺乳动物胶原蛋白制品的生产与销售。

从20世纪70年代人们就开始从鱼皮、鱼骨、鱼鳞等部位提取胶原蛋白，研究发现魚皮胶原蛋白与陆生哺乳动物胶原蛋白在理化特性、化学组成和溶液性质等存在一定差异[4]，这更加激发了人们的研究热潮[5]。我国的鱼类资源非常丰富，水产业加工过程中产生了大量的下脚料，比如鱼皮、鱼头、鱼骨、鱼鳞等，而这些废弃物约占鱼体总重的50%～70%，基本上被直接丢弃，如何将水产品加工过程中产生的大量下脚料变废为宝，充分利用生物资源是科研工作者亟待解决的问题之一，这不仅能产生可观的经济效益，更对保护生态环境具有重大意义。

1 鱼皮胶原蛋白的制备

1.1 鱼皮的预处理

鱼皮中的脂肪、非胶原和其他杂质会影响胶原的纯度，降低胶原蛋白的提取率，所以在提取胶原蛋白之前必须进行鱼皮的预处理。酸碱处理法和有机溶剂处理法是目前应用最广泛的前处理方法，一般先将鱼皮去除鱼鳞，清洗干净后用一定浓度的NaOH或NaCl浸泡，使鱼皮软化，目的是去除肌原纤维，破坏其胶原成分[6]。

1.2 鱼皮胶原的提取

迄今为止，鱼皮胶原蛋白的提取方法可分为5类：酸法、碱法、酶法、盐法和热水浸提法。在实际提取过程中，为了在保持胶原三螺旋结构的基础上提高胶原得率，不同的提取方法往往相互结合。

1.2.1 酸法提取

其原理是胶原蛋白分子间的盐键和席夫（Schiff）碱结构在低浓度的酸性条件下不稳定，从而进行蛋白提取，常采用醋酸、盐酸、柠檬酸、酒石酸等低酸度溶液。采用酸法提取胶原蛋白需严格控制酸浓度、水解温度和水解时间，防止胶原蛋白被彻底水解并破坏氨基酸组分[7]。用酸法提取的胶原蛋白得率比较低，常结合酶法一起提高胶原蛋白的提取率。Muyonga等[8]用乙酸从河鲈幼鱼和成鱼鱼皮中提取酸溶性胶原，得率分别为63.1%和58.7%（以干基计）。Nagai等[9]从虎鲨、鲐鱼及欧洲海鲈鱼的鱼皮中制备酸溶性胶原蛋白，得率分别为40.1%、49.8%和51.4%（以干基计）。Wang等[10]采用响应面分析法得到了草鱼胶原蛋白的最佳提取条件，即采用0.54 mol/L乙酸于24.7 ℃提取32.1 h，所得的酸溶性胶原蛋白的得率为（19.3±0.5）%。

1.2.2 碱法提取

其原理是碱性溶液可以与胶原蛋白相结合的脂肪发生皂化反应，使非螺旋端肽被切除，从而使胶原纤维溶出，常用的碱溶液有石灰石、氢氧化钠和碳酸钠。Kolodziejska等[11]采用NaOH处理鱿鱼皮制得碱溶性胶原蛋白，得率只有3%（以失重计）。Jin等[12]利用采用响应面法的中心复合设计方法，对金枪鱼加工得到的黄鳍金枪鱼背鳍皮进行胶原蛋白提取的优化研究，NaOH浓度在0.92 mol/L，处理24 h后，加入胃蛋白酶至浓度为0.98% （w/v），消化23.5 h，提取得到胶原蛋白得率为27.1%（以失重计）。

1.2.3 酶法提取

这是最常用的提取方法，常用的酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等[13-14]。酶法提取胶原蛋白具有反应速度快、时间短，提取的胶原蛋白纯度高，水溶性好，且没有改变三螺旋结构，只是引起了a1和a2链的展开，胶原蛋白的抗原性降低了，这些优点更适合作为医用生物材料[15]。Nagai等[16]从单眼河豚和墨鱼皮中提取的胃蛋白酶促溶性胶原蛋白（PSC）的得率分别为44.7%和35%（以干基计）。Ogawa等[17]从多须石首鱼和羊鲷鱼皮中提取的PSC分别为15.8%和29.3%（以湿基计）。林琳[18]利用酶工程技术，以鱿鱼、鳕鱼和鲤鱼为主要研究对象，通过选择适宜的蛋白酶和控制酶解过程，研究开发水产胶原蛋白及其寡聚肽制品，在温度55 ℃，pH为8.0，酶与底物浓度比为4%的条件下，用碱性蛋白酶properase E水解鱼皮胶原蛋白多肽产率最高。以血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性为指标，确定酶解制备胶原蛋白ACE抑制肽的最佳反应条件为：酶与底物比为2%、pH为2.0、水解温度为45 ℃、水解时间5 h。

1.2.4 盐法提取

对于组织中交联度低的胶原蛋白可以采用盐法提取，常用的中性盐溶液有氯化钠、氯化钾、柠檬酸钠等，该提取方法会影响胶原蛋白构象的稳定性，一般不适合工业化应用。

秦玉青等[19]研究了用2%的氯化钠溶液从鱿鱼皮中提取了盐溶性胶原蛋白，其得率为63.8%（以湿基计）。吴文惠等[20]使用磷酸氢二钠缓冲液（100 mmol/L，pH 7.4～7.6）浸泡马鲛鲨皮提取胶原蛋白，鲨鱼皮胶原蛋白回收率为鲜重的2.9%～4.1%，研究还发现提取条件的不同会影响胶原蛋白的热变性温度和二级结构。

1.2.5 热水浸提法

热水提取法是原料经过前处理后，进一步用热水处理，其溶解性得到了大大提高，一般胶原蛋白的提取率会随着温度的升高而提高。由于高温会导致胶原蛋白的超螺旋结构发生破坏，因而不具备胶原蛋白的生理功能，该方法提取的胶原蛋白也称为明胶。Jamilah等[21]用酸、堿预处理黑、红罗非鱼皮，采用热水浸提制备胶原蛋白，得率分别为5.39%和7.81%（以湿基计）。赵睿等[22]利用响应面优化得到鳕鱼皮胶原最佳提取条件为pH 5.0，在42 ℃下提取25.7 h，在最优条件下胶原蛋白的提取率为83.75%。

1.3 几种提取方法的应用讨论

胶原蛋白的提取方法根据不同的原料和提取介质而采取不同的方法。水产鱼皮、鱼鳞胶原蛋白与陆生胶原蛋白相比，更易受温度、pH、酶等外部环境的影响，所以热稳定较低，在胶原蛋白提取的过程中需要考虑水产动物的生存条件。比如，六齿金线鱼、黑鳍鲨鱼、点纹斑竹鲨鱼、白鲢的变性温度在34 ℃；尼罗河鲈鱼的变性温度为36.5 ℃；而六斑二齿鲀的变性温度只有29 ℃。另外，同一种类水产动物的不同组织部位的变性温度也有差异，比如章鱼触手的变性温度为22.5 ℃，外套膜的变性温度是27.5 ℃。无脊椎动物和硬壳类水产动物很难用酸提取法提取胶原蛋白，通常采用酸法和酶法相结合，以提高胶原蛋白的得率。利用碱法提取胶原蛋白容易造成肽键水解，因此得到的水解产物分子量比较低。如果水解严重，则会产生DL-型氨基酸消旋混合物，其中有些D-型氨基酸有毒，甚至有致畸和致突变作用[13]。若想保留胶原的三股螺旋结构，此法不可取。

酶法提取比传统的酸法、碱法提取更温和、安全和专一。随着近年来酶制剂的工业发展及其提取优势，应用越来越广泛。酶法提取胶原蛋白的试验步骤及条件通常要根据开发的产品对分子量的要求而定，要得到分子量较小的胶原多肽常采用多酶水解法，还要考虑酶的种类、加酶量、酶解时间和pH。

上述方法均存在一定的缺点，其中热水浸提法提取的胶原蛋白大多变性为明胶，需对温度严格控制；盐提取方法会影响胶原蛋白构象的稳定性，生物活性降低；碱法提取会破坏胶原蛋白的氨基酸序列并且产生有毒的物质；酸法提取的胶原蛋白可保留三股螺旋结构，但提取时间长，提取率低；酶法提取虽然得率高，但水解不够彻底。基于单一提取方法的不足，在实际的提取过程中常采用酸、酶的结合使用。

2 鱼皮胶原蛋白的性质

2.1 结构分析

通常胶原蛋白由三条多肽链构成的三股螺旋结构，每一条左旋形成左手螺旋结构，然后以氢键相互咬合形成牢固的右手螺旋结构。胶原特有的左旋a链相互缠绕构成胶原的右手复合螺旋结构，这一区域称为“螺旋区段”，螺旋区段的最大特征是氨基酸呈现 （-Gly-X-Y-）-（-Gly-X-Y-）-周期性排列。 X、Y位置为脯氨酸（Pro）和羟脯氨酸（Hyp），其中甘氨酸（Gly）约占 30%，Pro和Hyp约占25%，Hyp是胶原蛋白特有的氨基酸。

目前，脊椎动物胶原蛋白的类型有27种[23]，鱼皮中的胶原类型是Ⅰ型胶原蛋白和Ⅴ型胶原蛋白，其中Ⅰ型胶原是最主要的分子类型，其分子质量为30万道尔顿，直径1.5 nm，纤维长280 nm，由三条a链形成螺旋结构[24]。也有研究发现，胶原蛋白含量越高，鱼肉的质地越硬，鱼肉的嫩化被认为与Ⅴ型胶原蛋白降解有关，其肽链的破坏引起细胞外周胶原纤维的裂解，被认为是肌肉嫩化的主要原因。

2.2 热稳定性及溶解性

鱼皮胶原蛋白在低温下也易溶于中性盐溶液、稀酸和酸性缓冲溶液中。目前研究发现鱼皮胶原蛋白热稳定性比陆生动物要低，并且鱼皮胶原蛋白的热稳定性与鱼类的种特异性相关，这是因为亚氨基酸（Pro和Hyp）存在差异。Hyp在胶原蛋白中参与跨链氢键的形成，可以稳定胶原的三螺旋结构，所以一般从生存在较冷环境的鱼类中获得的胶原蛋白中Hyp含量较低，热稳定性较差。越来越多的研究证实，鱼皮胶原蛋白的热稳定性与Hyp含量呈正相关[25]。

3 鱼皮胶原蛋白及其酶解产物的研究热点

胶原是一种优良的可降解的生物材料，在医学上广泛用于伤口敷料、人工皮肤、组织工程海绵体、可降解缝合线等[26]。鱼皮胶原蛋白及其酶解产物胶原活性肽已引起人们的深入研究，胶原多肽是胶原经蛋白酶降解后的产物，主要有血管紧张素Ⅰ转化酶抑制肽、抗氧化活性肽、抗肿瘤活性肽和免疫调节肽等。研究发现，胶原活性肽具有多方面的生理功能[27]，如保护胃黏膜以及抗溃疡作用、抑制血压上升、促进皮肤胶原代谢及Ca2+吸收和降低血清中胆固醇含量等。海洋生物来源的蛋白质无论是氨基酸组成还是氨基酸序列均与陆地生物来源的蛋白有较大差异，同时，由于生物漫长的进化过程，海洋生物蛋白资源的种类和数量均远超陆地生物蛋白资源，这是人类的天然宝库，故具有生物功能的低分子活性肽的开发更是研究的热点。目前已有陆生动物源和植物源的活性多肽产品上市，如谷胱甘肽、酪蛋白肽、乳清肽、血清肽、大米肽、玉米肽等。另外，鱼皮胶原蛋白热稳定性较差，如何提高鱼皮胶原蛋白的热稳定，也将是值得关注的问题。随着鱼皮胶原蛋白在生物医学材料方面和化妆品领域中的研究开发，不同鱼种来源的胶原蛋白与人体的生物相容性、皮肤吸收渗透性、免疫原性等方面有待更加深入的研究[28]。

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