孟庆森，季烨，张学成，朱娜娜，武华

（华威特（江苏）生物制药有限公司，泰州 225300）

牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）是黄病毒科（Flaviviridae ）瘟病毒属（Pestivirus ）的代表种，在分类上与猪瘟病毒（Classical swine fevervirus，CSFV）和边界病毒（Border disease virus，BDV）同为一属，抗原性有交叉性反应[1～4]。该病毒可感染牛、羊、猪等多种家畜和野生反刍动物，但以牛为主。受感染牛表现为发热、白细胞减少、腹泻、流产、黏膜糜烂溃疡等急性感染症状及小牛先天持续性感染[5～7]。1946年Olafson等首次在美国东北部地区发现并分离出BVDV。

李佑民等[8]1980年首次从国外引进牛的流产胎儿中分离并鉴定出BVDV，从此证明该病在我国存在。郑志刚等[9]1980～1990年10年间对国内牛、羊进行BVDV血清学普查，14 581份牛血清中BVDV中和抗体阳性率为19.15%；1993年，王新平等[10]在内蒙古地区对绵羊的BVDV调查中，阳性率为14.6%～83.3%，表明绵羊BVDV在我国处于蔓延趋势。为了解我国目前BVDV的感染情况，笔者在部分地区进行了BVDV血清学调查，为该病的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1．1 样品

在内蒙古通辽、林西和吉林九台、安徽阜阳、山东聊城、江苏徐州等地区分别采集犊牛血液样品105份、89份、55份、97份、66份、39份，共计451份。每份血样采集3～5mL，置于抗凝采血管（肝素或EDTA抗凝剂），2～8℃保存运至实验室。

1．2 主要试剂

超纯RNA提取试剂盒，购自北京康为世纪生物科技有限公司；BVDV阳性血清（批号∶005-033）、BVDV阴性血清（批号：20150311）均为实验室制备。

1．3 试验设计

1.3.1 BVDV血清抗体效价的测定

用含3.5%马血清的DMEM细胞培养液对灭能后待检样品、BVDV阳性对照和阴性对照血清在96孔U型板内进行2倍系列稀释，稀释度为1∶2、1∶4和1∶8。每个稀释度接种2孔，每孔0.1mL。用含3.5%马血清的DMEM将BVDV中和抗原稀释为200TCID50/0.1mL。将稀释好的BVDV中和抗原液按每孔0.1mL加到含有血清的96孔U型板中，置37℃、含5%CO2培养箱内中和1h。取培养16～24h、长成良好的MDBK96孔培养板细胞，弃去生长液，将中和1h的病毒与血清的混合物转移至96孔细胞培养板相应孔内，每孔0.1mL，置于37℃、含5%CO2培养箱培养并观察4d，用Spearman-Karber法计算血清中和抗体效价。1.3.2 RT-PCR

取待检样品、阳性对照和阴性对照各100μL，按照超纯RNA提取试剂盒说明书进行提取，通过反转录获得cDNA，在PCR扩增仪上进行扩增； 95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环后72℃延伸10min。PCR产物用含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪系统下检测并记录结果，计算BVDV抗原阳性率。

2 结果与分析

2．1 BVDV血清抗体检测结果

表1 6个牛群的BVDV血清抗体阳性率

由 表 1 可 知，6 个 牛 群 的 犊 牛 血 清 中 和 试 验检测 的 BVDV 阳 性 率 分 别 为 76.2%、84.3%、91.1%、87.6%、81.8%、25.6%。451份样品中，阳性血清为354份，总阳性率为78.5%。牛BVDV抗体阳性率所反映的是牛只BVDV过往感染情况、母源抗体获得情况或疫苗免疫状况，说明78.5%的牛只已获得BVDV免疫力。通过BVDV中和试验的方法对犊牛血清样品的检测确定BVDV抗体阳性率，对我国牛病毒性腹泻的防治有一定的参考价值。

2．2 6个牛群的BVDV抗原检测结果

表2 6个牛群的BVDV抗原阳性率及阴性率

由表2可知，6个牛群的样品RT-PCR BVDV抗原检测的阳性率分别为1.9%、3.4%、0%、5.2%、0%、0%。抗原阳性说明犊牛可能已感染了牛病毒性腹泻病毒，或者犊牛本身为持续感染牛（PI）。

3 讨论

本次抽样检测结果表明，在不同省份采集的451份样品中，血清的BVDV中和抗体阳性率为25.6%～91.1%，阳性血清为354份，总的阳性率为78.5%。说明BVDV在我国多个省份普遍存在，同时各省份BVDV的阳性率存在较大差异；童钦等[11]对内蒙古自治区集约化养牛场病毒性腹泻的感染情况进行研究，乌兰浩特、巴彦淖尔、呼和浩特3个地区的平均阳性率分别为77.80%、48.70%、33.33%，总血清阳性率为58.35%。据王建领等[12]2012年的调查，牛病毒性腹泻流行范围已经遍及我国各地，最高血清抗体阳性率可达94.1%。近年来，许多血清学调查表明，牛病毒性腹泻在我国多个省市流行，随着养殖业的不断发展和奶牛养殖业的规模化，牛病毒性腹泻病毒对牛场的危害日益严重。当前，对牛病毒性腹泻进行血清学调查显得尤为重要，可为我国BVDV的防治提供科学依据[8]。

我国不同省份的牛病毒性腹泻病毒抗体水平存在不同的差异，现在不同省份地区的牛流通量比较大，牛病毒性腹泻病毒通过牛的运输进行传染的可能性比较大；建议在进行牛的运输时，能够通过检测BVDV抗原，预防BVDV的扩散；我国已经研制出了BVDV灭活疫苗（1型，NM01株），牛场可以通过疫苗免疫达到净化的目的，降低BVDV阳性血清的阳性率。国外牛疫苗种类较多，对于牛病预防体系比较完善，我国需加强疫苗的预防工作，希望能够通过不断的净化，减少BVDV抗体阳性率。