樊晴伶,高会军,张静瑜,王景杰

(空军军医大学第二附属医院消化内科,西安 710038;*通讯作者,E-mail:jingjie@fmmu.edu.cn)

应激性溃疡发病机制复杂[1],常规药物治疗方法是抑酸剂及黏膜保护剂的应用,若有溃疡并出血可采用药物治疗和内镜下治疗[2],如出血局部喷洒止血剂、高频电凝止血、激光止血、微波止血和热凝止血等。常见止血药物如血管收缩药物,垂体后叶素、生长抑素及其衍生物,口服或胃内灌注止血药如1%肾上腺素溶液及500-1 000 U凝血酶。上述治疗手段经过临床验证,均有一定疗效。但也存在一些不足之处,如往往单个药物治疗效果不好,有时需要联合使用不同的治疗措施;或存在全身性的不良反应如去甲肾上腺素有升高血压、加快心率的作用;还有的使用不方便,如需要注射给药或胃镜下给药。止血胶为我科自主研制,具有较好的临床应用价值,主要由白芨和阿胶起到治疗作用。中医认为,白芨性味苦、涩、寒,质黏而涩,入肺、胃、肝经,功能收敛止血,消肿生肌。药理学研究证实,白芨含大量黏液质,其中有多种聚糖,又含挥发油、淀粉,有缩短凝血时间及抑制纤溶作用,能形成人工血栓而止血[3]。阿胶的基本成分是驴皮所含胶原的降解物,善于止血,对一切失血之症均可应用,对出血而出现的血虚症候,应用阿胶既能止血,又能补血,有标本兼顾之效[4]。我们采用预先给予止血胶灌胃,通过观察应激相关细胞因子血清表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、白介素-12(interleukin,IL-2)、血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)变化,常规病理HE染色,黏附连接相关蛋白如黏着斑蛋白(vinculin,VCL)和黏着斑激酶(focal adhension kinase,FAK)表达的变化情况,从黏膜防御屏障探讨止血胶对大鼠应激性溃疡的预防作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂

成年雄性SD大鼠30只,体质量180-220 g，均由空军军医大学(原第四军医大学)实验动物中心提供。外科手术器械及其余试剂为本科实验室提供。止血胶购于唐都医院药剂科,铝镁加混悬液购于扬州一洋制药有限公司,ELISA Kit for Rat EGF、PAF、PAF均购于上海川翔生物科技有限公司,4%多聚甲醛戊巴比妥钠购于上海生物化学试剂公司。

1.2 动物分组及干预

将学校实验动物中心提供的SD大鼠,正常适应性饲养7 d。使用随机数字表将大鼠随机分为5组,每组6只,即:正常对照组,大平台组,单纯应激组,止血胶组,铝镁加组。正常对照组为正常饲养;大平台组给予大平台饲养,在平台上可自由活动及饮食水,自然昼夜光照;应激组使用小站台水环境法制备模型,给予5 d应激;止血胶组给予持续睡眠剥夺5 d,每日9:00及16:00止血胶灌胃,每次1 ml,2次/d,共5 d;铝镁加组给予持续睡眠剥夺5 d,每日9:00及16:00铝镁加混悬液灌胃,每次1 ml,2次/d,共5 d。

1.3 各组溃疡指数(UI)测定

应激时间完成后,将各组大鼠用戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉。将大鼠仰卧位固定于手术台上,胸腹部备皮后,沿胸骨两侧肋骨缘由下向上呈梯形逐层打开胸腔,暴露心脏。用5 ml注射器插入左心室,抽取2-4 ml血液。心脏取血完成后,逐层打开腹腔,分别在胃食管连接处及幽门远端剪下胃,取出并将其放置于生理盐水浸湿的纱布上,沿胃大弯剪开,生理盐水冲洗后拍照,将组织切成大小约1.0 cm×0.5 cm小块移于4%多聚甲醛中固定。溃疡指数按照Guth标准计算[5],即损伤程度依照胃黏膜条索状出血坏死斑的长度计算,≤1 mm为1分,≤2 mm为2分,≤3 mm为3分,依次类推,损害宽度>2 mm者指数加倍。

1.4 各组胃黏膜HE染色

取材胃组织块，经固定后，常规石蜡包埋，10 μm切片；每个标本切片4张。切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯(I)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min→100%乙醇2 min→95%的乙醇1 min→80%乙醇1 min→75%乙醇1 min→蒸馏水洗2 min。苏木素染色5 min，自来水冲洗。盐酸乙醇分化30 s(提插数下)。自来水浸泡15 min或温水(约50 ℃)5 min。置于伊红液中2 min。常规脱水，透明，封片：95%乙醇(I)1 min→95%乙醇(Ⅱ)1 min→100%乙醇(I)1 min→100%乙醇(Ⅱ)1 min→二甲苯石碳酸(3 ∶1)1 min→二甲苯(I)1 min→二甲苯(Ⅱ)1 min→中性树脂封固。显微镜下观察并采集图样储存。

1.5 各组血清学EGF、IL-2、PAF水平检测

将各组大鼠血清样本逐渐复温后,使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行EGF、IL-2、PAF水平检测。

1.6 各组胃黏膜VCL、FAK免疫荧光组织染色

各组切片依次使用0.01 mol/L PBS分别漂洗3次后,在室温条件下置入含0.3% Triton X-100的0.01 mol/L PBS中浸泡30 min,再经0.01 mol/L PBS液漂洗后进行免疫荧光染色。各组选2张切片,分别加入一抗即兔抗大鼠VCL单抗、兔抗大鼠FAK单抗,避光4 ℃孵育过夜(12 h)。第2日将切片置于室温下复温1 h,经0.01 mol/L PBS漂洗3次后,先后加入1 ∶1 000 FITC标记的驴抗兔IgG二抗及1 ∶1 000 TexasRed标记驴抗羊IgG二抗,室温孵育3 h经PBS漂洗3次后,封片。染色完成后,用荧光显微镜观察切片并采集图样储存。

1.7 图像及数据处理

2 结果

2.1 溃疡指数

与正常对照组比较,大平台组UI值未见明显变化,而单纯应激组大鼠的胃黏膜损伤严重,表现为UI明显增加(P<0.01),给予止血胶及铝镁加药物处理后,可显著减少胃黏膜损伤程度,差异有统计学意义(P<0.05)。与铝镁加组相比,止血胶组的UI值差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。

组别溃疡指数正常对照组2.6±0.89大平台组3.2±0.83单纯应激组53.40±2.55#止血胶组11.0±2.13∗铝镁加组13.4±1.95∗

与正常对照组相比,#P<0.01;与单纯应激组相比,*P<0.05

2.2 胃黏膜HE染色

正常对照组和大平台组胃黏膜结构完整,腺体排列规律。单纯应激组可见腺体排列松散,部分黏膜连接被破坏、上皮缺损,大量炎性细胞浸润。铝镁加组及止血胶组腺体排列松散,但黏膜破坏及炎性细胞浸润均较应激组减轻(见图1)。

2.3 止血胶对睡眠剥夺大鼠血清EGF、IL-2、PAF水平的影响

与正常对照组相比,大平台组大鼠血清EGF、IL-2、PAF水平未见明显变化(P>0.05),而单纯应激组血清EGF、IL-2表达明显下降,PAF明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。止血胶组与铝镁加组EGF、PAF水平与正常对照组比较,未见明显变化(P>0.05),IL-2水平表达水平降低,统计学检验有意义(P<0.05);与单纯应激组比较,止血胶组与铝镁加组EGF、IL-2水平明显增高,PAF水平明显下降,差异均有统计学意义(P<0.0,5见表2,图2)。

A.正常对照组;B.大平台对照组;C.单纯应激组;D.止血胶组;E.铝镁加组图1 各组大鼠胃黏膜损伤组织学比较 (HE)Figure 1 Comparison of histological changes of gastric mucosa injury among five groups (HE)

组别EGFIL-2PAF正常对照组0.49±0.164.68±0.3345.14±5.54大平台组0.41±0.064.59±0.4848.92±5.53单纯应激组0.22±0.04#1.36±0.34#86.87±10.36#止血胶组0.40±0.07∗2.54±0.48∗56.29±8.93∗铝镁加组0.45±0.07∗3.01±1.43∗53.31±10.73∗

与正常对照组相比,#P<0.05;与单纯应激组相比,*P<0.05

2.4 止血胶对睡眠剥夺大鼠胃黏膜VCL、FAK表达的影响

大鼠胃黏膜VCL、FAK荧光光度值检测结果显示,正常对照组及大平台组大鼠胃黏膜VCL、FAK呈稳定的高水平表达状态。与正常对照组相比,应激组、止血胶组及铝镁加组VCL、FAK表达均下降,有统计学意义(P<0.05)。与应激组相比,止血胶组及铝镁加组VCL、FAK表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05,见表3、图3、图4)。

组别 VCLFAK正常对照组89.33±6.3571.33±3.14大平台组85.78±3.1669.33±3.55单纯应激组56.33±2.58#43.33±3.51#止血胶组65.23±4.82#∗54.03±2.76#∗铝镁加组63.37±2.88#∗56.21±7.29#∗

与正常对照组相比,#P<0.05;与单纯应激组相比,*P<0.05

与正常对照组相比,#P<0.05;与单纯应激组相比,*P<0.05图2 大鼠血清EGF、IL-2、PAF水平比较Figure 2 Comparison of serum levels of EGF,IL-2 and PAF in rats among five groups

3 讨论

应激性溃疡是指在各种应激状态下,特别是在严重应激因素刺激下(全身感染、大面积烧伤、休克、多器官功能衰竭等),胃、十二指肠发生的急性、多发性黏膜浅表糜烂、溃疡、出血等。部分严重病例可表现为上消化道大出血或穿孔,是各种危重疾病常见并发症,预后不良,常常危及患者生命。其发病机制复杂,目前尚不完全明确。因其有严重的不良后果,预防意义大于治疗。对于应激性溃疡相关的预防研究可概括为两种:一种是抑酸剂的预防研究[6,7],另一种是黏膜保护剂的相关研究。黏膜保护相关方面的研究主要集中在硫糖铝、铋剂、新型铝镁制剂等,近年来对于中药对于应激性溃疡的预防研究很受关注,如黄芪、丹参等;铝镁制剂,如铝镁加,为镁氢氧化铝、碳酸盐、氢氧化镁和水的化合物,因其有独特的网状结构,在酸性环境下结合胆汁酸,又可中和胃酸,在碱性环境时,又将胆汁酸释放,从而不影响胆酸的肠肝循环,不影响营养物质的吸收。相关研究表明铝镁加中镁可明显降低胃内胆汁酸含量,且有中和胃酸的作用,能够预防和减轻应激性溃疡的发生。中药相关研究表明丹参能够有效地预防应激所致的胃黏膜损伤,其机制可能与促进内源性前列腺素的合成、释放和抗氧化活性有关[8,9]。

黏着斑蛋白(vinculin,VCL)是一种高度保守的骨架蛋白,主要分布于钙黏素介导的细胞-细胞连接处及整合素介导的细胞-细胞外基质连接的胞质面,并且在紧密连接中也起重要作用[10]。近年研究发现VCL与黏着斑的很多生物学功能相关[11]。FAK在细胞黏附连接中扮演着关键作用,通过与相应配体结合后经不同的信号转导通路,调节细胞生存、增殖、周期调控、迁移、铺展、凋亡及胚胎的生长发育等多个生理功能。在DSS诱发的大鼠结肠炎模型中,肠胶质细胞通过分泌proEGF,激活FAK依赖的信号通路,从而促进肠黏膜愈合[12]。炎症因子激活FAK后可以调整细胞间局部黏附,从而改变屏障功能[13]。在肠黏膜上皮细胞的相关研究中发现,FAK在溶血磷脂酸LPA诱导的细胞迁移、板状伪足形成及黏着斑的聚集等过程中发挥重要作用,这些功能与黏膜损伤后修复密切相关[14];TGF与细胞的修复及增殖密切相关,其部分机制可能就是通过FAK参与的,研究表明,在大鼠肠黏膜上皮细胞TGF可以增加FAK蛋白mRNA水平[15]。

止血胶是我科自主研制,并广泛应用于平时和战时,对于消化道出血具有很好疗效的中药复合制剂。我们主要利用了阿胶和白芨消炎、止血、生肌的作用。一般消化道止血剂在消化道活动性出血灶处不易停留,我们研制的止血胶既有止血作用,又黏附于出血部位而疗效显著。另外,从应激性溃疡的角度来看,应激性溃疡不但牵涉到胃肠道黏膜的损伤,而且应激导致的神经调节以及胃肠道黏膜血流甚至神经内分泌的变化等综合因素均参与了上述变化,但是其最终的变化还是胃肠道黏膜产生了损伤性的改变,并且诸多的炎症性因子参与其中。故此,我们针对止血胶具有很好的抗炎作用,以及毒副作用小、可安全使用的中药特性进行研究,对于中药的成分开发和机制研究具有十分重要的意义。