高丽丽 吴成翰 蔡伟武

红景天苷（salidroside）又称蔷薇红景天苷，具有抗疲劳、抗缺氧、增强免疫功能及双向调节等功效。红景天苷是红景天属植物药用价值的主要质量指标。《本草纲目》记载“红景天苷，本经上品，祛邪恶气，补诸不足”是“已知补益药中所罕见”。红景天苷在临床已广泛应用，近年来众多研究表明自噬参与脑出血后的继发性损伤[1-2]，研究表明红景天苷可改善创伤性脑损伤大鼠模型的神经功能，具有强大的抗细胞凋亡的作用，可降低脑外伤后的脑水肿及细胞凋亡作用[3]。红景天苷在脑出血后还可以通过抗NF—KB的产生而达到降低血脑屏障的通透性，降低脑水肿[4]。本研究拟从分子生物学角度探讨红景天苷对脑出血后细胞自噬的影响，为今后脑出血的治疗提供实验研究。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠120只，实验动物许可证号：S CXK（闽）2016-0002，由福建中医药大学提供。

1.2 药品

红景天苷（由上海源叶生物科技有限公司提供，生产批号：C13J8Q39713，规格：20 mg）；3-甲基腺嘌呤（3-MA）（由美国Selleck Chemicals公司提供，生产批号：S276711，规格：50 mg）；雷帕霉素（rapa）（由美国Selleck Chemicals公司提供，生产批号：S103911，规格：25 mg）。

1.3 试剂

Beclin 1一抗由美国Santa公司提供，生产批号：sc-21527；LC3I一抗由英国Abcam公司提供，生产批号：ab48394；Cathepsin D一抗由美国Santa公司提供，生产批号：sc6486；P62一抗由美国Santa公司提供，生产批号：sc-48431；二抗由英国Abcam公司提供，羊抗兔IgG，生产批号：ab175762。

1.4 仪器

手术刀、颅骨钻、脑立体定位仪、100 μL微量注射器、微量泵（美国Rwdls公司），小型转印槽（美国Bio-rad公司），多功能酶标仪（瑞士TECAN公司），凝胶成像系统（美国WEALTEC公司）。

2 方法

2.1 造模方法

大鼠脑出血模型参照Rosenberg[5]方法进行，将大鼠用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，俯卧位固定于立体定位仪上，取头皮正中，备皮消毒，正中切口，骨膜剥离器剥离骨膜，暴露前囟及冠状缝，取Bregma点（前囟）右旁开3.5 mm，后0.2 mm定点，用牙科钻钻直径为1.0 mm的圆孔，深达硬脑膜表面，鼠尾酒精消毒，距尾端3 cm处剪断鼠尾，用微量注射器取血50 μL，将微量注射器固定于立体定位仪上，沿钻孔进针约6 mm，将未肝素化的静脉血50 μL以20 μL/min速度推进尾状核，留针约5 min，缓慢出针。留针期间酒精棉球包扎鼠尾断端伤口，术后局部喷洒庆大霉素，用牙科水泥封闭颅骨伤口，缝合头皮，局部皮肤采用碘酒消毒，防止局部感染。

2.2 动物分组

将120只SD大鼠按随机数字表法随机分为6组，每组20只，具体分组如下：（1）正常对照组；（2）模型对照组；（3）假手术组：（4）红景天苷组；（5）红景天苷+3-MA组；（6）红景天苷+雷帕组。

2.3 动物给药

（1）正常对照组：正常SD大鼠，喂饲标准饲料，每日灌服生理盐水1 mL，每日上午一次，一疗程14 d；（2）模型对照组：复制脑出血SD大鼠模型，喂饲标准饲料，每日灌服生理盐水1 mL，每日上午一次，一疗程14 d；（3）假手术组：正常SD大鼠，俯卧位固定大鼠，于前囟门前1 mm，正中线旁开2 mm，切开皮肤，用穿刺针钻孔3 mm，不注入自体血，缝合皮肤。喂饲标准饲料，每日灌服生理盐水1 mL，每日上午一次，一疗程14 d；（4）红景天苷组：复制脑出血SD大鼠模型，喂饲标准饲料，每日灌服红景天苷混悬液1 ml，每日上午一次，一疗程14 d；（5）红景天苷+3-MA组：复制脑出血SD大鼠模型，喂饲标准饲料，每日灌服红景天苷混悬液1 ml和腹腔注射自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（0.5 mg/kg/d，溶于含10%乙醇的生理盐水1 ml），每日上午一次，一疗程14 d；（6）红景天苷+雷帕组：复制脑出血SD大鼠模型，喂饲标准饲料，每日灌服红景天苷混悬液1 ml和腹腔注射自噬激动剂雷帕霉素（0.2 mg/kg/d，溶于含10%乙醇的生理盐水1 mL），每日上午一次，一疗程14 d。

2.4 大鼠神经功能评分

采用Bederson[6]评分法分别于造模成功后及14 d对各组大鼠进行神经功能评分：0级：无神经功能缺损，记0分；Ⅰ级：将大鼠尾巴提起，瘫痪侧前肢回收屈曲于腹下，正常侧前肢向地面伸展，记1分；Ⅱ级：除Ⅰ级体征外，向瘫痪侧推大鼠时阻力较健侧降低，无转圈行为，记2分；Ⅲ级：除以上体征外，伴自发性旋转，记3分。

2.5 脑出血神经细胞自噬相关蛋白LC3I、Beclin 1、Cathepsin D、P62表达

采用蛋白免疫印迹法检测：PBS（pH7.4）心脏灌注，小鼠断头，取脑，分为左右半球，取穿刺侧脑组织根据蛋白免疫印迹方法检测。超声破碎含脑组织的lysis缓冲液，离心取上清液，进行蛋白浓度的测定。取50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜，洗膜，5%无脂牛奶封闭，以及一抗、二抗的孵育，使用化学发光法检测目的蛋白条带。

表1 各组大鼠造模后Bederson评分比较（分， ±s）

表1 各组大鼠造模后Bederson评分比较（分， ±s）

注：治疗14 d后假手术组、红景天苷组及红景天苷+雷帕组与模型组比较，t值分别为2．01、1．58、1．36，P值为0．00，红景天苷+3MA与模型组比较，t值为1．01，P值为0．01，均△P＜0．05；治疗14 d后假手术组、模型组、红景天苷+雷帕组与红景天苷组比较，t值分别为 1．79、1．18、1．76，P值为 0．00，##P＜ 0．01。红景天苷 +3MA 与红景天苷组比较，t值为 1．01，P值为 0．01，#P＜ 0．05，；治疗 14 d后红景天苷+雷帕组、假手术组与红景天+3-MA组比较，t值分别为1．23、0．96，P值均为0．00，* P＜0．05，* * P＜0．01

正常对照组2000假手术组200．26±0．020．23±0．09 △★★##模型对照组203．20±0．663．03±0．43##★★红景天苷+3-MA组203．10±0．711．90±0．49△#红景天苷组203．06±0．731．30±0．54 △★红景天苷+雷帕组203．06±0．630．63±0．19 △★★##

表2 各组大鼠间自噬相关蛋白LC3I、Beclin 1、Cathepsin D、P62比较（分， ±s）

表2 各组大鼠间自噬相关蛋白LC3I、Beclin 1、Cathepsin D、P62比较（分， ±s）

注：治疗14 d后模型组与正常对照组比较，t值为9．61，P值为0．03，红景天苷+3-MA组、红景天苷组、红景天苷+雷帕组与正常对照组比较，t值分别为 7．23、6．98、6．13，P值为 0．01，*P＜ 0．05；B 组与 C 组比较，t值为 9．02，P值为 0．03，红景天苷 +3-MA 组、红景天苷组、红景天苷+雷帕组与模型组比较，t值分别为9．35、9．02、8．11，P值均为0．01，△P＜0．05；红景天苷+3-MA组、红景天苷组、红景天苷+雷帕组与假手术组比较，t值分别为7．65、7．08、6．15，P值为0．01，▲P＜0．05；红景天苷+3-MA组与红景天苷组比较，t值为1．05，P值为0．04，红景天苷+雷帕组与红景天苷组比较，t值为2．13，P值为0．02，#P＜0．05；红景天苷+雷帕组与红景天苷 +3-MA 组比较t值为 2．65，P值为 0．01，&P＜ 0．05

正常对照组 14 d 20 0．66±0．02△&# 0．47±0．01△&# 0．86±0．01△&# 0．48±0．01△&#假手术组 14 d 20 0．68±0．03△&# 0．47±0．05△&# 0．87±0．05△&# 0．47±0．05△&#模型对照组 14 d 20 0．48±0．03*▲#& 0．43±0．01*▲#& 0．40±0．01*▲#& 0．31±0．02*▲#&红景天苷 +3-MA 组 14 d 20 0．29±0．02*△▲# 0．27±0．03*△▲# 0．26±0．05*△▲# 0．16±0．05*△▲#红景天苷组 14 d 20 0．20±0．04*△▲& 0．16±0．03*△▲& 0．17±0．03*△▲& 0．15±0．01*△▲&红景天苷 + 雷帕组 14 d 20 0．11±0．03*△▲&# 0．10±0．01*△▲&# 0．09±0．02*△▲&# 0．06±0．02*△▲&#

2.6 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件分析数据。计量资料符合正态分布，用（±s）表示，两组比较采用t检验，多组比较用单因素方差分析；计量资料不符合正态分布，用中位数表示，组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠Bederson评分比较

由表1所知，造模后脑出血各组Bederson评分均较正常对照组及假手术组升高，表明脑出血大鼠造模成功；经治疗后红景天苷干预各组Bederson评分均低于模型对照组，表明红景天苷在脑出血后发挥神经功能保护作用，其中红景天苷+雷帕组评分最低，红景天苷组次之，红景天苷+3-MA组评分最高，提示红景天苷+雷帕组疗效最佳（P＜0.01），表明红景天苷在脑出血后的神经功能改善作用可能与调节自噬有关。

3.2 各组大鼠自噬相关蛋白LC3I、Beclin 1、Cathepsin D、P62比较

图1 红景天苷对大鼠脑出血后自噬相关蛋白的影响

如图1和表2所示，各组治疗14 d后，与正常对照组、假手术组、模型对照组比较，红景天苷干预各组的LC3I、Beclin 1、Cathepsin D、P62表达均下降，表明红景天苷具有调节细胞自噬的作用，其中联合自噬激动剂雷帕霉素组的LC3I、Beclin 1、Cathepsin D、P62表达最低，红景天苷组次之，红景天苷加3-MA组表达最高，表明红景天苷在脑出血后可激活自噬，而发挥神经保护作用。

4 讨论

现代药理研究表明，红景天苷有抗过氧化、抗炎消菌、强心、抗疲劳、免疫调节、降糖、抗辐射等作用。其还能提高血液中血红蛋白的数量，增强血红蛋白携氧能力，提高血液中的氧含量，具有抗缺氧等作用。因其补益作用强于人参、刺五加，且没有燥热引起便秘等不良反应，被誉为高原人参[7]。众多实验研究表明红景天苷在大鼠脑缺血再灌注后发挥抗细胞凋亡的保护作用[8-9]。

自噬（autophagy）是细胞通过隔离膜包裹细胞质和（或）细胞器等物质形成自噬体，然后将其运送到溶酶体，再形成自噬溶酶体并进行多种酶的消化和降解的过程。自噬在脑损伤后发挥重要调节作用，可处理受损的细胞，将细胞受损程度减到最低，避免细胞产生永久伤害而发挥保护作用。研究表明，自噬为脑出血后的继发性损伤的重要途径[10]。Beclin 1是酵母自噬相关基因Atg6的哺乳细胞同源基因，与早期自噬体形成有关，是其他自噬蛋白基因参与自噬形成过程的必需成分，其表达情况可体现自噬现象的发生[11-13]；微管相关蛋白1轻链3（LC3）是自噬体膜上的标志性蛋白[14-15]，有2种形态，LC3I位于细胞浆内，LC3II位于细胞膜上，LC3II与LC3I的表达可反映细胞内吞噬体形成的数目，是检测自噬的重要标志性蛋白；Cathepsin D是介导自噬过程的重要蛋白，研究表明其能介导自噬的过程，调节自噬泡的形成[16]；P62（sequestosome 1 protein，SQSTM1）是一个泛素化结合蛋白，参与自噬过程并被降解。P62在多种细胞和组织中都有表达，通过自噬小体与溶酶体完成蛋白的降解[17]。当自噬被抑制时，P62的降解减少、蛋白水平升高，而P62的增加则暗示着自噬溶酶体降解途径被抑制[18-19]。

综上所述，本实验通过检测脑出血大鼠模型自噬相关蛋白的表达提示，红景天苷干预各组脑出血后自噬相关蛋白均较模型组降低，且其在红景天苷加自噬激动组的表达最低，提示红景天苷可能参与了大鼠脑出血后的病理生理过程，在脑出血后可起到改善神经功能的作用，其机制可能通过调节细胞自噬而发挥神经保护作用，有望成为脑出血治疗的新方法。