袁 泉，赵 博，刘 恋，黎 梅，王雅枫，夏中元

(武汉大学人民医院麻醉科，武汉 430060)

生物的昼夜节律是生物体适应周期性环境变化的先天性能力。昼夜节律能够通过重置自己的节律适应不断变化的环境[1]，但昼夜节律的长时间中断也会对大脑的生理和生物学行为产生负面影响，甚至可能会导致代谢和心脏生理功能紊乱，最终导致脑血管事件[2]。事实上，一日内脑卒中事件的发生率在不同时间点也具有差异性。尽管全天都有可能发生脑缺血事件，但研究表明，卒中的发生率在早上6点至下午2点增加，特别是患者清醒后的2 h内；而在午夜至早上6点降低[2]。由此可见，生物的昼夜节律不仅影响着正常的生理活动，而且对病理性改变也有影响。在哺乳动物昼夜节律的核心负反馈环中，Bmal1-Clock复合体是关键的调控元件，其与Period(Per)基因上的E-box结合驱动的转录激活和抑制是哺乳动物内源性昼夜节律性的主要基础[3]。现就时钟基因Bmal1在脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制进行讨论。

1 时钟基因Bmal1

生物钟是由各种起调控作用的信号分子和自动调节反馈生理活动的各种回路共同作用形成的[4-5]。Bmal1-Clock复合体通过结合Per基因上的E-box启动子，激活Per和Cryptochrome(Cry)两个时钟基因的转录。反过来Per-Cry复合体也会抑制Bmal1-Clock复合体的活性，从而关闭负反馈环[5-7]，这一过程发生在昼夜节律的主观白昼，也就是说在主观白昼，Bmal1的表达量是减少的；而在主观夜晚期间，Cry的降解可重新激活Bmal1-Clock复合体，并重新启动Cry和Per转录[8]。说明Bmal1转录翻译的震荡在昼夜节律的形成中起重要作用。

研究表明，Bmal1存在多种形式的翻译后修饰，而这些调控对其功能转变起重要作用[9]。Bmal1是SUMO(small ubiquitin-like modifier)化的底物，而这种修饰在生物钟振荡现象的形成中不可或缺[10]。研究证实，Bmal1也存在泛素化，并且Bmal1-Clock的活性与Bmal1泛素化的水平密切相关；Bmal1的磷酸化图谱表现出强烈的昼夜节律[11-12]；Bmal1的乙酰化也存在节律性，研究表明，组蛋白去乙酰化蛋白家族的活性也存在一定的节律性，并受烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性去乙酰化酶(sirtuin)家族的调控，而sirtuin家族与Clock结合并被招募到Clock-Bmal1染色质复合物上，导致Bmal1的Lys9/Lys14位点被节律性地乙酰化，从而引起下游一系列级联反应[13]。以上研究表明，Bmal1受到多种形式的修饰，从而引起一系列重要的昼夜节律性改变，与生物体昼夜节律的形成密切相关。Bmal1也影响着生物体内从代谢到细胞程序性死亡等多种重要的生理病理过程。

脑缺血损伤状态下，生物体的昼夜节律发生紊乱，会失去其原有节律。在分子水平，时钟基因的转录水平、翻译后修饰水平的正常节律会发生变化[14]，而这些变化又会进一步引起病理性变化。

2 Bmal1与脑缺血再灌注损伤

缺血再灌注损伤发生在组织血供被阻断后再次恢复血供的各种临床医疗环境中，如突发疾病(如心肌梗死、脑卒中)、择期手术(如移植、血管手术或应用止血带的手术)等。世界范围内，急性缺血性脑卒中因脑血流量减少而导致脑功能丧失是致残和致死的主要原因之一，经治疗血运重建后可能会出现严重的并发症，而缺血再灌注损伤便是其中之一。研究人员观察脑卒中发生率时间变异性的同时发现，在Zeitgeber time(ZT)18时，时钟蛋白PerⅠ、Clock、Bmal1的表达量显著增加，脑卒中发生率降低与Bmal表达量增加这两个事件在时间上有重合[2]。另有研究表明，与正常脑组织相比，发生缺血再灌注损伤的脑组织时钟基因Bmal1表达的昼夜节律及转录、翻译后修饰水平发生了变化[14]，这种缺血区与非缺血区之间生物钟节律的不同步性会加剧脑缺血的发生和发展[15]。

脑缺血再灌注损伤的病理生理机制包括兴奋性毒性神经递质的释放、细胞内Ca2+的积累、自由基损伤、神经元凋亡、神经炎症以及脂解作用[16-22]。Bmal1是通过何种途径影响脑缺血再灌注损伤过程中的哪一环节仍在研究中。从目前的研究成果来看，Bmal1不仅仅作用于脑缺血再灌注损伤中的某一单一机制，而是多重影响脑缺血再灌注损伤的结果，并且损伤机制也会影响Bmal1的转录和翻译。

2.1Bmal1与氧化应激 在脑缺血再灌注损伤复杂的病理生理机制中，自由基学说起到了关键作用。自由基分为活性氧类和活性氮两大类。氧自由基过量导致的氧化应激在脑缺血再灌注损伤中有重要作用。在组织缺血再灌注过程中有4种途径可以产生过量的氧自由基：线粒体呼吸链，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化过程，环加氧酶2催化的花生四烯酸反应，黄嘌呤和次黄嘌呤氧化过程[23]。过量的氧自由基可引起氧化应激并造成DNA损伤、脂质过氧化以及蛋白质结构和功能的改变，从而导致细胞死亡。虽然大脑仅占人体体重的2%，但脑组织耗氧量占人体总耗氧量的20%，故产生的自由基远多于其他器官。此外，脑组织含有大量脂质、不饱和脂肪酸以及高水平的铁离子[24]，因此大脑更易受氧自由基的损伤[25-26]。另外，活性氧类还可以调控细胞凋亡和坏死的信号通路，如p53和Bcl-2家族蛋白(Bax、Bid以及p53上调凋亡调节因子)等；调节细胞死亡的促分裂原活化的蛋白激酶通路也受活性氧类的调节[27-28]。综上，氧化应激是脑缺血再灌注损伤的重要机制之一。

氧化应激受时钟基因Bmal1的调控。研究发现，昼夜节律蛋白Bmal1及其二聚化伴侣Clock通过控制活性氧类的产生和氧化应激参与组织稳态的调控[28-30]。Bmal1转录水平下降会导致超氧自由基生成增加[31]。在缺血性脑卒中中活性氧类的表达水平升高，低氧诱导因子1α蛋白活化，对神经元起保护作用，而Bmal1和Clock的过表达可导致在ZT18时低氧诱导因子1α被直接或间接激活，提示Bmal1可能直接或间接调控机体内的氧化应激[32]。Khapre等[28]研究发现，Bmal1-/-小鼠肾脏中活性氧类的水平升高，在心脏和脾脏中活性氧类的水平也随着时间的推移而逐渐升高。给予抗氧化剂(N-乙酰-L-半胱氨酸)后，Bmal1-/-小鼠脏器内的氧化应激水平降低[33]。更有研究指出，Bmal1可调节大脑中氧化还原基因的表达，从而调控组织中氧化应激的水平[28]。

神经元的氧化应激会导致神经元细胞死亡和星形胶质细胞变性。在小鼠原代神经元中，抑制Bmal1的表达与用化学诱导剂诱导氧化损伤都会促使神经元死亡和纹状体神经变性；而Bmal1缺失会导致突触末梢受损变性，进而导致皮质连接功能受损以及神经元氧化应激损伤加重，并诱导氧化还原防御基因的表达[9,33]。但在缺乏Per1和Per2的小鼠的大脑中并未观察到星形胶质细胞的增生[34]。在果蝇中，Per基因的缺失加剧了脑组织的神经变性[35]。尽管Per已被证明可以促进Bmal1-Cry的相互作用，但敲除Per基因后，Cry依旧能有效抑制Bmal1的转录[34,36]。所以在Per-Cry复合体中，Cry被认为是主要的阻遏物。因此，之前提及的研究只能表明Bmal1对机体氧化应激水平的调控不受Per的影响，但并不能表明Bmal1与机体氧化应激水平的调控和生物节律没有关系。因此，有关Cry对Bmal1蛋白功能的影响以及氧化应激的昼夜节律还需进一步研究。

2.2Bmal1与血管内皮功能障碍及微血管重塑 血管功能障碍是很多心脑血管疾病的发病基础。虽然氧化应激在机体内普遍存在，但血管内皮NO依赖性血管舒张功能下降可导致内皮细胞更易受氧自由基的损害。NO由内皮细胞产生并释放，但去向取决于氧自由基，如超氧化物(O2-)易与NO结合[37]。这种“清除”作用减少了可用于引起平滑肌细胞松弛的NO的量，导致NO依赖性血管舒张功能受损。因此，氧化应激被认为是降低NO生物利用度以及促进内皮功能障碍发展的主要原因。NO由谷氨酸代谢生成，在糖尿病患者体内会逐渐累积，并在视网膜毛细血管变性中起重要作用；其次在超氧化物的存在下，NO会迅速形成强氧化剂——过氧亚硝酸盐，其与蛋白质快速作用，导致硝基酪氨酸形成[38]。来自Bmal1flox/flox; Tek-Cre小鼠(Bmal1特异性敲除的内皮细胞表达特异性受体酪氨酸激酶的工具鼠)视网膜缺血再灌注损伤模型的视网膜样本显示，硝基酪氨酸强烈染色，提示NO信号在介导缺血再灌注损伤中起关键作用[39]。研究表明，Bmal1敲除小鼠存在内皮功能障碍，与正常小鼠相比，Bmal1基因敲除小鼠对乙酰胆碱及NO依赖性血管舒张反应的能力严重受损，更重要的是，Bmal1基因敲除小鼠的血管会发生病理性重塑，在缺血情况下，血管损伤会增加[40]。推测NO与Bmal1之间形成了调控环路[40]。

细胞衰老可能参与血管内皮功能障碍和心脑血管疾病的病理生理过程。研究显示，脑细胞衰老与血管内皮功能障碍的发生具有一定的联系，其机制可能与机体氧化应激反应增加、间充质干细胞增殖分化异常等相关[34]。在缺血再灌注脏器中，活性氧类的聚集以及脂质代谢异常等促进正常细胞进入衰老程序，即应激诱导性衰老，从而丧失正常的结构和生理功能。因而，清除氧自由基、恢复氧化还原反应平衡能减少血管内皮功能障碍的发生，减轻灌注损伤和衰老等疾病的发生。研究表明，Bmal1-/-小鼠不仅表现出生物钟节律紊乱，还存在早衰现象，表现为局部神经细胞功能退化及连接功能丧失，具有激活炎症和损伤的特征，同时还表现出异常血管重塑，增加了老年动物颈动脉血栓形成的易感性[41]。下调内皮细胞中Bmal1的水平促进了微血管和大血管的损伤，导致微血管重塑与新生内皮增加[31]。研究者在Bmal1基因敲除的缺血再灌注模型小鼠的视网膜无细胞毛细血管中观察到，无细胞毛细血管的数量较野生型小鼠增加了3倍，表明Bmal1-/-小鼠的微血管增生重塑大幅上升。同样的，与股动脉损伤的野生型小鼠相比，Bmal1-/-小鼠损伤的股动脉新生内皮增生增加20%[39]。更有研究进一步表明，Bmal1可能是通过抑制单核细胞的聚集，来减轻血管内皮的炎性损伤以及动脉粥样硬化[42]。

2.3Bmal1与兴奋性神经递质 谷氨酸盐是主要的兴奋性氨基酸，能激活多种信号转导的级联反应。该神经递质参与昼夜节律的光诱导作用，从而调节人类的生理和行为功能。研究人员用谷氨酸能配体刺激鸡小脑Bergmann神经胶质细胞的原代培养物发现，Bmal1的水平呈剂量-时间依赖性增加[43]。此外，在谷氨酸刺激下，Bmal1中丝氨酸残基的磷酸化增加[43]。Bmal1表达的增加很可能是环腺苷酸依赖性蛋白激酶和(或)Ca2+/二酰基甘油依赖性蛋白激酶磷酸化后稳定化的结果[11]。目前认为，谷氨酸参与调节神经胶质细胞中Bmal1的表达，而这些细胞可能在控制小脑的昼夜节律中起重要作用。有学者用神经递质谷氨酸100 μmol/L、5-羟色胺10 μmol/L以及多巴胺10 μmol/L同时处理星形胶质细胞，导致Bmal1的表达增加[44]。以上研究提示，脑缺血再灌注损伤时释放的神经递质可诱导Bmal1表达，并调节翻译后修饰。

2.4Bmal1与神经元的凋亡及自噬 Bmal1通过调控活性氧类的水平影响细胞凋亡和坏死信号通路，p53、Bcl-2家族蛋白(Bax、Bid)、促分裂原活化的蛋白激酶通路都是活性氧类诱导细胞死亡的关键通路[27,45]。有证据表明，与其他时间点诱导的缺血相比，午夜(ZT18; 24:00)诱导的小鼠脑缺血再灌注损伤梗死体积少、脑肿胀轻、神经功能缺损评分低、神经元存活率高、凋亡细胞少[46]，而这可能与昼夜节律蛋白Bmal1表达的增加有关。

自噬是细胞内自我降解的过程，自噬体与溶酶体融合后降解自噬体内过量或受损的细胞器和细胞质。虽然自噬通常被认为是促进细胞存活的，但其也在细胞死亡过程中起作用。有研究报道认为，缺乏生物钟蛋白的小鼠对脑缺血有更高的易感性[39-40]，进一步研究发现，这一现象与生物钟基因依赖性调节凋亡/自噬标志物的表达有关[47]。

3 结 语

氧化应激是导致脑缺血再灌注损伤的重要机制，而Bmal1也被证实在氧化应激水平的调节中起重要作用，因此推测Bmal1对脑缺血再灌注损伤也有一定的影响。Bmal1作为时钟基因负反馈环中的关键调控元件，也调控着机体内的氧化应激水平、血管功能障碍以及血管重塑水平等，从而调控脑缺血再灌注损伤的发生、发展及预后。相对地，脑缺血再灌注损伤也可影响组织自身生物钟节律的改变，两者以类似于正反馈的形式相互作用。目前对于Bmal1具体是通过何种信号通路调控氧化应激水平的尚未有定论。未来，生物钟可作为一个新的治疗靶点，通过调节生物钟或其中某一重要环节如Bmal1-Clock复合体，减少脑组织缺血再灌注损伤，并对损伤起到一定修复作用。