徐 曼，余永强，侯唯姝，潘红利

(安徽医科大学第一附属医院放射科，安徽 合肥 230022)

胶质瘤是一种瘤内微血管高度增生的原发性脑肿瘤，呈浸润性生长，高表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)[1]。目前对于胶质瘤的标准治疗方案为手术联合放化疗[2-3]，但患者预后较差[4]，胶质瘤微环境呈乏氧状态是影响疗效的主要因素[5-6]。既往主要采用检测氧分压、PET等评估胶质瘤微环境的乏氧程度，但氧分压检测为有创性检查，PET具有辐射，且二者均不能动态评估乏氧状态。体素内不相干运动DWI(intravoxel incoherent motion-DWI， IVIM-DWI)采用多个b值获取系列DWI，可区分水分子扩散与血液灌注信息，反映活体内的微观运动。本研究探讨IVIM-DWI评估SD大鼠C6脑胶质瘤模型肿瘤微环境乏氧状态的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择清洁级SD大鼠48只，雄性，体质量250～300 g，由安徽医科大学实验动物中心提供[许可证号：scxk(皖)2017-001]。本研究经我院动物伦理委员会论证并通过。

1.2 胶质瘤模型建立 对体外培养处于80%对数生长期的大鼠胶质瘤C6细胞进行消化，制备浓度为108/ml～1010/ml的细胞悬液备用。将SD大鼠麻醉后保定于定位仪，暴露术区颅骨，以冠状缝前1 mm、矢状缝右3 mm为钻孔点钻开颅骨。采用微量注射器抽取C6细胞悬液10 μl，自钻孔点进针至硬脑膜下6 mm时后退1 mm，将细胞悬液缓慢注入大鼠脑实质，注射速度约1 μl/min，注射完毕停留5 min，拔针。封闭颅骨钻孔，缝合切口，待大鼠苏醒后送回动物房饲养。

1.3 仪器与方法 采用GE Discovery MR750W 3.0T MR 扫描仪，4通道实验动物专用线圈。在造模第14、21及28天分别取大鼠16只，对其行头部扫描，采集常规MRI及IVIM-DWI。FSE T1WI：FOV 6 cm×6 cm，矩阵256×256，层厚2 mm，间距0.5 mm，TR 2 532.1 ms，TE 24 ms； FSE T2WI：FOV 6 cm×6 cm，矩阵256×256，层厚2 mm，间距0.5 mm，TR 4 746 ms，TE 120 ms。IVIM-DWI：FOV 6 cm×6 cm，矩阵128×128，层厚2.4 mm，NEX 4，TR 3 000 ms，TE 102.4 ms，FA 90°，扩散敏感系数b值分别取0、10、20、50、100、200、400、600、800 s/mm2。

1.4 图像分析 由2名影像科主治医师阅片，意见不同时经协商达成一致。采用GE ADW 4.6工作站提供的MADC软件对IVIM-DWI(图1)进行后处理，在肿瘤实性成分最明显的连续3个层面上勾画ROI，避开出血及坏死区域，获得参数ADC、纯扩散系数(D)、伪灌注扩散系数(D*)及灌注分数(f)。

1.5 病理分析 每次MR扫描后处死大鼠，以4%甲醛溶液灌注心脏后取胶质瘤组织，石蜡包埋后切片，行HE染色及缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α)免疫组织化学染色(图2)。

图1 造模不同时间SD大鼠C6脑胶质瘤模型头部IVIM-DWI伪彩图 A～D.分别为造模第14天时ADC(A)、D(B)、D*(C)、f(D)伪彩图； E～H.分别为造模第21天时ADC(E)、D(F)、D*(G)、f(H)伪彩图； I～L.分别为造模第28天时ADC(I)、D(J)、D*(K)、f(L)伪彩图

时间ADC(×10-4 mm2/s)D(×10-4 mm2/s)D*(×10-3 mm2/s)fHIF-1α评分第14天3.07±1.354.41±1.094.90±1.310.38±0.081.38±2.09第21天4.28±1.13*8.08±0.87*3.07±1.00*0.49±0.07*5.94±3.73*第28天4.60±1.11*8.27±1.10*4.80±1.52#0.26±0.09*#4.00±2.00*#F值6.7271.5910.0835.6211.28P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

注：*：与第14天比较，P<0.05；#：与第21天比较，P<0.05

图2 SD大鼠C6脑胶质瘤模型肿瘤组织HIF-1α免疫组织化学染色图(×100) 细胞质内出现棕色颗粒为HIF-1α阳性细胞，造模第14天(A)阳性细胞较第21天(B)及28天(C)减少，第28天(C)阳性细胞较第21天减少

以细胞质内出现棕色颗粒状物判定为HIF-1α染色阳性。低倍镜(×100)下观察切片，随机选择5个HIF-1α阳性细胞密集区，高倍镜(×200)下对密集区内阳性细胞进行计数，每个视野计数100个细胞(排除非特异性染色细胞)。根据视野内HIF-1α阳性细胞占所有细胞的百分比及阳性细胞染色程度对免疫组化结果进行评分：无HIF-1α阳性细胞为0分，HIF-1α阳性细胞占所有细胞的百分比<10%为1分、10%～50%为2分、>50%～75%为3分、>75%为4分；细胞质无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。以2项评分的乘积作为HIF-1α评分结果。

1.6 统计学分析 采用SPSS 16.0统计分析软件。符合正态分布的计量资料以±s表示。采用单因素方差分析比较各时间点间IVIM-DWI参数及HIF-1α评分的差异，2时间点间比较采用SNK-q检验。以Pearson相关分析观察各时间点IVIM-DWI参数与HIF-1α评分的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

常规MRI：造模第14天肿瘤组织呈T1WI低信号、T2WI稍高信号；造模第21天肿瘤组织较造模第14天稍增大，呈T1WI低信号、T2WI稍高信号；造模第28天肿瘤内见坏死区，坏死区呈T1WI低信号、T2WI高信号。HE染色：造模第14天肿瘤细胞分布密集；第21、28天见部分肿瘤细胞坏死，坏死区细胞数减少、细胞核裂解，且第28天坏死区面积较第21天增大。

2.1 各时间点IVIM-DWI参数及HIF-1α评分比较 造模第14、21及28天，IVIM-DWI各参数及HIF-1α评分比较差异均有统计学意义(P均<0.01)。与造模第14天比较，造模第21天ADC、D、f及HIF-1α评分均升高，D*降低；造模第28天ADC值、D及HIF-1α评分均升高，f降低；差异均有统计学意义(P均<0.05)。与造模第21天比较，造模第28天D*升高、f及HIF-1α评分均降低(P均<0.05)。见表1。

2.2 IVIM-DWI参数与HIF-1α评分的相关性 造模第14天IVIM-DWI各参数与HIF-1α评分均无明显相关性(P均>0.05)；造模第21天D、D*、f与HIF-1α评分均呈负相关(r=-0.73、-0.58、-0.67，P均<0.05)；造模第28天D、f与HIF-1α评分均呈负相关(r=-0.60、-0.65，P均<0.05)；造模第21及28天HIF-1α评分与ADC均无明显相关性(P均>0.05)。

3 讨论

胶质瘤通过刺激新生血管生成以保证氧气及其他营养成分的供应，但新生血管内皮细胞功能不全，当肿瘤细胞氧消耗大于氧供应，且营养成分如糖类等供给不能满足细胞增殖所需时，造成肿瘤微环境乏氧，肿瘤组织内出现乏氧区；乏氧严重导致细胞坏死、细胞核裂解，并逐渐发展为坏死区[7-8]。胶质瘤组织出现乏氧坏死区是导致其耐药、预后不良的原因之一。目前临床主要通过检测氧分压评估胶质瘤微环境的乏氧状态及程度，但该检查有创，患者接受度低；PET等影像学方法亦可用于评估胶质瘤微环境的乏氧状态及程度，但具有辐射。

IVIM-DWI以多b值获取系列DWI图像，根据双指数模型拟合，获得组织扩散系数和微毛细血管灌注信息[9]。低b值扫描获得的DWI反映组织内血流灌注及水分子扩散，且以对前者的反映为著；高b值扫描图像仅反映组织水分子扩散；故采用多b值扫描的IVIM-DWI可将肿瘤组织血流灌注和水分子扩散分开，且无创、无需使用对比剂[10]。有研究[11-12]发现，IVIM-DWI可用于指导胶质瘤术前病理分期、鉴别高级别胶质瘤和转移瘤等。本研究拟采用IVIM-DWI评估SD大鼠C6脑胶质瘤模型肿瘤微环境乏氧状态。

既往研究[13]报道，氧敏感转录因子HIF-1α可感知肿瘤细胞氧及葡萄糖缺乏，表现为HIF-1α在肿瘤组织邻近坏死区周围的乏氧区高表达。本研究免疫组织化学化染色结果显示，造模第14、21及28天HIF-1α评分比较差异均有统计学意义(P均<0.01)，且造模第21及28天HIF-1α评分均高于第14天，提示随着胶质瘤的进展，肿瘤微环境出现乏氧；但造模第28天HIF-1α评分较第21天降低，可能原因为造模第21、28天肿瘤内出现坏死区，且第28天坏死区面积大于第21天，使乏氧区相对减小，HIF-1α表达降低。

IVIM-DWI结果显示，造模第14、21及28天IVIM-DWI各参数比较差异均有统计学意义(P均<0.01)，且造模第21天D、D*、f与HIF-1α评分均呈负相关，造模第28天D、f与HIF-1α评分均呈负相关，提示IVIM-DWI可能反映肿瘤微环境的乏氧状态。造模第28天ADC、D与第21天比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，可能原因为选取ROI时人为避开坏死区，使2个时间点ROI内肿瘤细胞密度相似，水分子扩散受限程度亦相似；造模第14天与第28天D*比较差异无统计学意义(P>0.05)，可能是造模第28天时肿瘤内乏氧区发展为坏死区，肿瘤组织内血流发生变化，导致检测到的D*可能存在误差。造模第21、28天时HIF-1α评分与D均呈负相关，可能原因为这2个时间点肿瘤乏氧区HIF-1α表达水平较高，且乏氧区肿瘤细胞数量多、排列密集，导致水分子扩散受限。造模第21、28天HIF-1α评分与f呈负相关，f与血流量及血容量有关，反映肿瘤组织的灌注情况，造模第21、28天肿瘤细胞增殖快，能量及营养缺乏，HIF-1α表达增加，但坏死区的出现使血液灌注相对下降，故HIF-1α评分与f呈负相关。造模第21天HIF-1α评分与D*呈负相关，而造模第28天二者无明显相关性，可能原因为中枢神经系统的血流量相较于其他系统少，且D*易受肿瘤内细胞异质性及乏氧区血供等因素干扰，影响D*准确性[14]。造模第14天时IVIM各参数与HIF-1α评分均无明显相关性，原因可能为造模第14天肿瘤体积较小，血液及糖类等营养供给尚可，尚未形成明显乏氧及坏死区。造模第14、21及28天时HIF-1α评分与ADC均无明显相关性，可能原因为胶质瘤细胞异型性和水分子扩散运动的复杂性，使ADC不能准确反映肿瘤细胞密度等特征。

综上所述，IVIM-DWI能够用于评价SD大鼠C6脑胶质瘤模型肿瘤微环境乏氧状态。但随着乏氧程度增加，坏死区逐渐增大，导致肿瘤组织血流发生变化、肿瘤细胞侵袭性增加等，影响IVIM-DWI参数的准确性；此外，本研究样本量相对较少，且选取ROI时人为避开坏死区，动物模型受饲养环境等影响，HIF-1α免疫组织化学结果受染色环境、大鼠灌注效果等影响；故本研究尚需进一步完善。