李 欣1,2,3,黄石宽2,陈 雄2,姚 娟3,李志军3,常 旭3,廖 蓓3,陈向东

(1.武汉大学生命科学学院,湖北武汉 430072; 2.教育部发酵工程重点实验室,工业微生物湖北省重点实验室,湖北省工业发酵协同创新中心,湖北工业大学,湖北武汉 430068; 3.湖北安琪酵母股份有限公司,湖北宜昌 443003)

白酒是中国特有的固态酿造酒类,是多种多样的微生物混合发酵的结果。白酒酿造微生物呈现出种类多和分布广(涵盖原核微生物中的细菌和放线菌,真核微生物中的霉菌和酵母,以及古细菌),并具有相当的复杂度(多种微生物参与同一过程;同种微生物具有不同生理和代谢特征)[1]。其中,芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌、己酸菌等几大类群是主要的细菌群落[2-5]。如,地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌是大曲发酵过程中的优势细菌[6-7]。酿酒酵母属、伊萨酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属和德克酵母属也是白酒中常见的酵母类微生物[8-9]。

传统的白酒固态酿造的时空环境,为不同性状和营养特异的微生物构建了生存和代谢的时间区间和微区域。然而,白酒发酵传统工艺周期长,步骤复杂,转化率低,品质稳定性不高。利用现代生物发酵技术开发白酒液态发酵技术是中国白酒工业的一项重大技术改革。田梁等人以高粱糖化液为原料,采用序批式固定化菌液态发酵白酒工艺,确定固定化生香酵母、乳酸菌、己酸菌的最佳添加量,获得总酸和总酯含量分别为486.62和258.28 mg/L的白酒[10]。唐取来等人以粉碎大米为原料,纯种培养的根霉曲、高产酯适量低产高级醇酿酒酵母和乳酸菌为糖化发酵剂,结合液化酶、糖化酶和酸性蛋白酶的使用,通过全液态法工艺酿造出高总酯含量且风味物质均衡的米香型白酒[11-13]。相对于传统固态法白酒,液态发酵法生产白酒具有出酒率高、机械化连续化程度高和劳动效率高等优点,但其存在风味物质丰富程度不足的问题,从而使液态法白酒口味淡薄、单一,缺乏固态法发酵白酒的自然感。可见,液态法生产白酒还有大量关键技术需要突破。阐明不同微生物混合发酵的发酵代谢特征就是这些方面之一。风味组分的变化受到广泛的关注[14-21],实际上,除自身的营养功能外,氨基酸还是滋味的贡献者,也可作为风味前体物参与风味的形成[22],而氨基酸代谢却极少引起重视。本研究以芽孢杆菌与酵母菌的混配发酵,研究不同搭配条件下的氨基酸代谢特性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、酿酒酵母(Saccharomycecerevisiae)、汉逊酵母(Hansenula)、弗比恩毕赤酵母(Pichiafabianii)、鲁氏结合酵母(Zygosaccharomycesrouxii) 湖北宜昌安琪酵母股份有限公司提供;小麦粉 购自武汉市太阳行食品有限责任公司;酵母粉、蛋白胨(生化试剂) 均购自北京双旋微生物培养基制品厂;乳酸标准品(50 mg/100 mL) 购自山东科学院生物研究所;氨基酸标品[甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)、谷氨酰胺(Gln)、蛋氨酸(Met)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、脯氨酸(Pro)和组氨酸(His)] 均购买于Sigma公司;3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)(分析纯)、氢氧化钠、无水乙醇、吡啶、氯仿、碳酸氢钠和无水硫酸钠 均购自国药集团化学试剂有限公司;氯甲酸乙酯(Ethyl chloroformate,ECF) 购自成都市科隆化学品有限公司;葡萄糖(食品级) 购自山东祥瑞药业有限公司;体积分数95%酒精(医用级) 购自武汉兴和达商贸有限公司;YEPD(Yeast Extract Peptone Dextrose)培养基 酵母粉10 g,蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,蒸馏水1000 mL,自然pH;LB(Luria-Bertani)培养基 酵母粉5 g,蛋白胨10 g,氯化钠10 g,蒸馏水1000 mL,pH7.2～7.4;发酵培养基 5 g小麦粉中添加100 mL水,搅拌混匀,自然pH。

SBA生物传感仪 山东省科学院生物研究所;CJ-2D无菌操作台 天津泰斯特仪器有限公司;BL-75A高压灭菌锅 上海博迅实业有限公司;HNY-211B恒温摇床 天津欧诺仪器仪表有限公司;ZSD-A1160A恒温培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司;CT15RE离心机 日本日立公司;V-1100D可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;5804R型离心机 德国Eppendorf公司;带有FID检测器的7890B气相色谱仪 美国安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 种子活化 从微生物保藏斜面分别挑取适量的地衣芽孢杆菌菌落到LB培养基或酵母菌落到YEPD培养基中,37 ℃(地衣芽孢杆菌)或30 ℃(酵母菌)、180 r/min振荡培养至OD600达到3.0(地衣芽孢杆菌)或20.0(酵母菌)。分别取1 mL酵母和地衣芽孢杆菌培养种子液于无菌离心管中,8000 r/min离心5 min,去除上清,并在沉淀物中加入1 mL无菌水,充分混匀后全部转入发酵培养基中。

1.2.2 混合发酵 将接种有地衣芽孢杆菌和酵母菌的发酵培养基置于恒温振荡摇床中,在30 ℃、180 r/min下振荡培养216 h,且每隔24 h取样用于检测分析。

1.2.3 指标测定方法

1.2.3.1 还原糖浓度测定 参照文献[23],取0.5 mL去离子水适当稀释的发酵液离心上清液(4 ℃、8000 r/min下离心10 min得到)中加入0.5 mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS),沸水中水浴10 min,冷却后加入4.0 mL去离子水,混匀后测定540 nm吸光值。以响应值为纵坐标,葡萄糖浓度为横坐标,建立标准曲线方程:Y=1.5031X-0.0509,R2为0.9982。

1.2.3.2 乙醇浓度测定 参照文献[24],采用SBA生物传感仪检测乙醇浓度。发酵液在4 ℃、8000 r/min下离心10 min,收集上清液,用去离子水适当稀释后用于测定。样品进样量为25 μL。用乙醇标准液对生物传感仪进行定标。乙醇标准液的配制(现用现配):将25 μL无水乙醇加入100 mL容量瓶中,并用去离子水定容,所配得乙醇质量浓度为20 mg/100 mL。

1.2.3.3 氨基酸浓度测定 参照文献[25],采用氯甲酸乙酯(ECF)衍生化处理样品,通过气相色谱检测氨基酸浓度。2%乙酸苯乙酯作为氨基酸相对定量的内标物。色谱柱为HP-5毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm,安捷伦,美国)。升温程序:70 ℃保留5 min,以5 ℃/min升到260 ℃,并保留2 min。进样量1.0 μL。不分流模式。流速1.0 mL/min;载气为氮气。进样口温度280 ℃;检测器温度280 ℃。

1.2.4 数据处理与分析 每组实验3个平行。运用Excel计算平均值和方差,并运用Origin 8.6软件对检测数据作图。

以混合氨基酸标准品色谱图为对照,依据保留时间对样品色谱图中的色谱峰进行定性分析,筛选出氨基酸色谱峰。以乙酸苯乙酯浓度作为依据,按照内标法计算各氨基酸组分的相对浓度。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌与酵母菌混酵基本特征

图1展现了地衣芽孢杆菌与单一酵母共酵过程中的还原糖与乙醇变化过程。当地衣芽孢杆菌与汉逊酵母混酵时,发酵液中还原糖浓度不超过2 g/L,而乙醇最大积累浓度达到(93.33±4.71) mg/L。然而,当地衣芽孢杆菌分别与另外三种酵母混酵后,发酵液中的还原糖逐步积累,最大浓度分别为(8.21±0.39) g/L(毕赤酵母,168 h)、(7.62±0.33) g/L(酿酒酵母,192 h)和(9.43±0.46) g/L(鲁氏酵母,216 h)。发酵液中乙醇的变化与还原糖变化相匹配,如图1B。毕赤酵母、酿酒酵母和鲁氏酵母与地衣芽孢杆菌混酵过程均无法高效地积累乙醇,最大乙醇浓度依次为(26.67±4.71) mg/L(96 h)、(13.33±4.71) mg/L(216 h)和(16.67±4.71) mg/L(168 h)。依据乙醇积累特征,与地衣芽孢杆菌混酵的酵母可明显分为两类。一类为适配酵母,即汉逊酵母,即能与地衣芽孢杆菌协调生长,也能高效地将碳源转变为乙醇。另一类为低适配酵母,包括毕赤酵母、酿酒酵母和鲁氏酵母。低适配酵母无法有效积累乙醇的可能原因是地衣芽孢杆菌对低适配酵母的生长代谢存在抑制效应[26],降低了酵母糖醇转化能力。

图1 地衣芽孢杆菌分别与四种酵母 共酵过程还原糖(A)和乙醇(B)变化Fig.1 Changes of reducing sugar(A)and ethanol(B)during the co-fermentation process of B. licheniformis and yeast注:BL表示地衣芽孢杆菌;H代表汉逊酵母;P表示弗比恩毕赤酵母;S表示酿酒酵母;Z表示鲁氏结合酵母。

2.2 氨基酸代谢分析

当地衣芽孢杆菌分别与汉逊酵母、毕赤酵母、酿酒酵母和鲁氏结合酵母混合发酵时,依次检测到16种、17种、11种和11种氨基酸。混酵条件下的最大总氨基酸浓度分别为(6149.79±375.51) μg/mL(汉逊酵母,96 h)、(6333.78±669.45) μg/mL(毕赤酵母,96 h)、(265.02±41.14) μg/mL(酿酒酵母,48 h)和(2061.36±194.76) μg/mL(鲁氏结合酵母,48 h)。甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸&谷氨酰胺、苯丙氨酸、组氨酸和酪氨酸共11种氨基酸在4种混合发酵条件下均被检测到,这些氨基酸被归为共有氨基酸。

当地衣芽孢杆菌和汉逊酵母混合时,除脯氨酸和组氨酸外,其它氨基酸在发酵前期均不积累,但从第96 h开始,所有氨基酸出现明显的积累过程。当地衣芽孢杆菌和毕赤酵母共存时,氨基酸的积累主要发生在发酵的前期,第120 h后,除脯氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和酪氨酸外,其它氨基酸不再积累或只有个别时间段少量积累。当地衣芽孢杆菌和酿酒酵母共酵时,亮氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸只分别存在发酵早期、中期和末期的样品中,缬氨酸、异亮氨酸和酪氨酸表现出振荡式积累过程。当地衣芽孢杆菌和鲁氏结合酵母混酵时,亮氨酸只在发酵初期的样品中被检测到,苏氨酸和苯丙氨酸只存在发酵后期的样品中,异亮氨酸在发酵中期缺失。

2.2.1 共有氨基酸分析 图2用雷达图的形式显示了4种混酵条件下的共有氨基酸的差异。汉逊酵母与毕赤酵母均有利于甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的积累,且促积累水平相似,这些氨基酸的最大浓度依次分别为:430.72 μg/mL(甘氨酸,汉逊酵母)和447.41 μg/mL(甘氨酸,毕赤酵母)、593.58 μg/mL(缬氨酸,汉逊酵母)和620.45 μg/mL(缬氨酸,毕赤酵母)、1111.06 μg/mL(亮氨酸,汉逊酵母)和922.99 μg/mL(亮氨酸,毕赤酵母)、903.55 μg/mL(苯丙氨酸,汉逊酵母)和789.77 μg/mL(苯丙氨酸,毕赤酵母)、526.72 μg/mL(酪氨酸,汉逊酵母)和436.82 μg/mL(酪氨酸,毕赤酵母)。此外,汉逊酵母和毕赤酵母还有利于苏氨酸浓度的增加,但汉逊酵母比毕赤酵母的促积累效果更好,其苏氨酸的最高浓度为468.49 μg/mL,是毕赤酵母的2倍。除酿酒酵母条件下没有明显积累,其它3种酵母均促进了脯氨酸水平的提高,最高水平分别为218.49 μg/mL(汉逊酵母)、312.34 μg/mL(毕赤酵母)和69.66 μg/mL(鲁氏酵母)。可见,汉逊酵母和毕赤酵母比酿酒酵母更利于脯氨酸积累。对谷氨酸和谷氨酰胺而言,汉逊酵母(Cmax378.44 μg/mL)、毕赤酵母(Cmax539.05 μg/mL)和鲁氏结合酵母(Cmax485.14 μg/mL)对它们的积累有相似的刺激作用,但最大积累浓度出现的时间不同。只有毕赤酵母能刺激异亮氨酸的积累,在发酵96 h达到最大浓度411.43 μg/mL,其它3种酵母没有显著的促积累效果。对组氨酸而言,只有鲁氏结合酵母能刺激此氨基酸的积累,在发酵48 h达到最大浓度1320.81 μg/mL。

图2 地衣芽孢杆菌与酵母共酵过程的共有氨基酸变化Fig.2 The changes of common amino acids during the co-fermentation process of B. licheniformis and yeast注:H表示汉逊酵母;P表示弗比恩毕赤酵母;S表示酿酒酵母;Z表示鲁氏结合酵母;浓度单位均为μg/mL。

2.2.2 非共有氨基酸分析 表1显示了地衣芽孢杆菌与酵母共酵过程的非共有氨基酸变化。丝氨酸、天冬酰胺、蛋氨酸、半胱氨酸和赖氨酸只在汉逊酵母或毕赤酵母存在时才出现。这些氨基酸在汉逊酵母与毕赤酵母之间的差异在于积累时间段显著不同。毕赤酵母主要在发酵前半阶段积累,而汉逊酵母主要在发酵后半阶段积累。在毕赤酵母中,丝氨酸、天冬酰胺、蛋氨酸、半胱氨酸和赖氨酸的最大浓度依次为(226.45±18.54) μg/mL(96 h)、(79.95±5.53) μg/mL(96 h)、(9.68±0.59) μg/mL(24 h)、(10.70±0.86) μg/mL(96 h)和(1027.50±244.97) μg/mL(96 h)。在汉逊酵母中,丝氨酸、天冬酰胺、蛋氨酸、半胱氨酸和赖氨酸的最大浓度依次为(222.37±40.02) μg/mL(96 h)、(64.61±4.14) μg/mL(120 h)、(41.65±7.73) μg/mL(216 h)、(14.84±0.77) μg/mL(96 h)和(1105.92±376.51) μg/mL(96 h)。可见,汉逊酵母比毕赤酵母更容易积累丝氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和赖氨酸,毕竟这些氨基酸在汉逊酵母中的浓度普遍高于毕赤酵母。

表1 地衣芽孢杆菌与酵母共酵过程的非共有氨基酸变化Table 1 The changes of non-common amino acid during the co-fermentation process of B. licheniformis and yeast

丙氨酸是地衣芽孢杆菌与毕赤酵母混合发酵所特有,只在发酵中前期积累,最大积累量为(210.76±11.29) μg/mL(96 h)。三种酵母与地衣芽孢杆菌混酵的区间性分布暗示这样一种可能性,即通过多酵母与地衣芽孢杆菌混合发酵有助于在发酵体系中形成更丰富的氨基酸成分。

3 结论

4种酵母与地衣芽孢杆菌混酵时对还原糖的利用能力和糖醇转化能力的区别提示在液态发酵白酒的研究中组合使用的微生物之间的适配性对白酒生产基础参数乙醇浓度起关键作用。同时,氨基酸代谢分析展现出不同微生物混酵下氨基酸代谢在特征代谢物、代谢强度和代谢时间区间上的差异,而这些差异很可能与最终风味差异存在一定的联系。总体而言,不同酵母混酵体系的差异应该来自微生物之间的相互作用和体系中各自微生物对环境的代谢适应这两个方面,而前者应该处于主导地位。因此,白酒酿造中的另外一种常见细菌枯草芽孢杆菌与不同酵母混酵的特点以及这两种芽孢杆菌在与酵母混酵体系的氨基酸代谢共性和差异性也是值得进一步研究的。应该看到,同一细菌菌株仅与不同酵母两两复配已经展现出一定程度的代谢多样性,可以预见当更多的微生物参与后,体系的复杂性和多样性会大幅提升,因果关系也越模糊,这也是白酒酿造研究中的主要难点。